Medios de cultivo: historia, función, tipos, preparación
Los medios de cultivo son preparaciones nutritivas especiales para la recuperación, aislamiento y mantenimiento de microorganismos bacterianos y fúngicos. Estos medios pueden ser sólidos, líquidos o semisólidos.
Louis Pasteur fue el primero en demostrar que en un caldo hecho con trozos de carne hervido servía para que las bacterias se reprodujeran en gran cantidad, hasta el punto de enturbiar el caldo. En este sentido, el caldo de carne de Pasteur es considerado el primer medio de cultivo líquido utilizado.
Luego Robert Koch, gracias a la ayuda de sus colaboradores Julius Richard Petri y Walter Hesse, logró grandes avances. El primero diseñó la placa de Petri, que aún se usa en la actualidad; y el segundo se le ocurrió sustituir la gelatina por agar–agar para preparar los medios de cultivo sólidos, lo cual fue muy relevante, ya que la gelatina era degradada por algunos microorganismos.
En la actualidad existen muchas clases de medios de cultivo con fines distintos, por tanto, estos se clasifican según su función: entre los más importantes se pueden mencionar los medios de cultivo nutritivo, selectivo, diferencial, de transporte, de enriquecimiento, de recuento de colonias, mantenimiento y para prueba de susceptibilidad.
Algunos medios de cultivo son especiales para observar reacciones químicas, siendo de gran utilidad para la identificación del microorganismo involucrado. Entre ellos se pueden mencionar: el medio Kligler, MIO, LIA, citrato, entre otros.
Índice del artículo
- 1 Historia
- 2 Composición
- 3 Tipos de medios de cultivo
- 4 Función
- 4.1 Medios de cultivo simples nutritivos
- 4.2 Medios de cultivo enriquecidos
- 4.3 Medios de cultivo selectivos
- 4.4 Medios de cultivo diferenciales
- 4.5 Medios selectivos y diferenciales
- 4.6 Medios de cultivo de transporte
- 4.7 Medios cultivo de enriquecimiento
- 4.8 Medios de cultivo con fines de identificación
- 4.9 Medios para contar colonias
- 4.10 Medios de cultivo para prueba de susceptibilidad
- 4.11 Medios de cultivo para mantenimiento
- 5 Preparación
- 6 Importancia
- 7 Control de calidad de los medios de cultivo
- 8 Desecho de los medios de cultivo
- 9 Referencias
El primer medio de cultivo fue preparado por Louis Pasteur cuando intentaba demostrar que la vida microbiana no era producto de la generación espontánea, sino que los microorganismos se podían multiplicar y además que provenían del aire.
El preparó un caldo con trozos de carne y observó que al cabo de unos días después de haber sido expuesto al aire, este se tornaba turbio y en el caldo había una cantidad apreciable de microorganismos. Al mismo tiempo, otro caldo con trozos de carne previamente hervido y herméticamente cerrado se mantuvo traslúcido al pasar los días.
Esto llamó la atención de muchos investigadores y se dieron cuenta que estos microorganismos eran los responsables de descomponer la carne y además de producir algunas enfermedades.
Por tal motivo, era indispensable crear una forma de poder reproducir a estos microorganismos en el laboratorio con la finalidad de estudiarlos más a fondo.
En este sentido, Robert Koch hizo un aporte invaluable en el mejoramiento de ciertas técnicas de laboratorio, especialmente las relacionadas con el aislamiento bacteriano, pues introdujo el concepto de medio de cultivo sólido.
Al principio usó rodajas de patatas como medio sólido pero luego agregó gelatina a los caldos de carne con mejores resultados. Sin embargo, había momentos en que la gelatina se derretía y se convertía en un cultivo líquido. Hoy se sabe que eso ocurre porque algunas bacterias son capaces de hidrolizar a la gelatina.
Fue entonces cuando a unos de sus colaboradores se le ocurrió la idea de usar agar-agar, un compuesto que usaba su esposa para espesar sus dulces.
Este medio de cultivo rudimentario poco a poco ha ido sofisticándose, hasta llegar a los medios de cultivo que hoy se conocen.
Cada medio tiene una composición diferente, pero es esencial que contenga los nutrientes específicos para un buen desarrollo del tipo de microorganismo que se busca.
También podrá contener sustancias químicas específicas que ayuden a revelar la vía metabólica que posee determinada cepa, o que evidencien la presencia de ciertas enzimas.
Otro elemento importante es el uso de sustancias amortiguadoras. Estos ayudan a mantener el equilibrio osmótico de los medios, así como el pH.
También pueden contener carbohidratos y un indicador de pH para evidenciar la fermentación del azúcar añadido. Se observará un cambio de color del medio si hay acidificación generada por la fermentación.
Algunos medios de cultivo contienen sustancias inhibidoras. Dependiendo la sustancia utilizada se restringirá el crecimiento de unos microorganismos y se favorecerá el de otros.
Los medios de cultivo se clasifican según diversos criterios. Estos son: según su consistencia, su composición y su función.
Líquidos
No contienen agar-agar. El crecimiento bacteriano o fúngico se evidencia por la turbidez del caldo, que originalmente es traslúcido.
Sólidos
Contienen entre 1,5 a 2% de agar-agar. La mezcla solidificada posee una superficie que resiste el fino desplazamiento del asa de platino, sin que este se rompa.
Semisólidos
Contienen 0,5% aproximadamente de agar-agar, por tanto, es un estado intermedio entre el líquido y el sólido. Ideal en medios que sirven para ver motilidad. También son recomendables para la conservación de cepas, pues estos mantienen por mucho más tiempo la humedad.
Bifásicos
Son medios que se preparan de tal manera que existe una fase sólida y sobre este un medio líquido. Muy utilizado para los hemocultivos.
Medios de cultivo naturales
Son sustancias tomadas directamente de la naturaleza para cultivar bacterias, brindándoles un ambiente lo más parecido a cómo se desarrollan en el ecosistema normalmente. Ejemplo, leche, jugos, sangre diluida, suero, etc.
Medios de cultivo sintéticos
Son los más utilizados hoy en día, son los medios deshidratados que adquirimos en las casas comerciales y a los cuales se les conoce toda su composición química, ya que han sido diseñados estratégicamente de acuerdo al tipo de microorganismo que se busca aislar.
Medios de cultivo semisintéticos
Es la combinación de un medio sintético al cual se le añade un elemento natural para enriquecer el medio.
Medios de cultivo celulares
Son medios especiales para el cultivo de virus, como estos microorganismos son incapaces de sobrevivir fuera de las células, estos deben contener tejido o células vivas, provenientes de un animal o una planta.
Ejemplo: los cultivos celulares de riñón de mono o los huevos embrionados.
Medios de cultivo nutritivos, selectivos, diferenciales, de transporte, de enriquecimiento, identificación, cuantificación de colonias, mantenimiento y pruebas de susceptibilidad. Se describirán más adelante.
Independientemente del tipo de medio de cultivo, todos tienen algo en común y es que facilitan o promueven la reproducción de ciertos microorganismos. La diferencia radica en la composición de cada uno de ellos, lo cual es un factor determinante para la utilidad final que tendrán.
Cada uno de los medios de cultivo existentes, está estratégicamente diseñado para la función específica para la que fue creado, es decir, todos cuentan con un fundamento que rige las directrices de su función específica.
Cabe destacar que los medios de cultivo una vez sembrados deben someterse a condiciones de temperatura y oxígeno adecuado al tipo de bacteria u hongo que se desea aislar.
Por ejemplo, si se quiere aislar bacterias anaerobias mesófilas, se podría usar agar sangre e incubar en condiciones de anaerobiosis (sin oxígeno) a 37 °C durante 48 horas.
Ahora bien, si se necesita aislar un hongo, se usa agar Sabouraud con antibióticos. Se incuba en aerobiosis, a temperatura ambiente por varios días, ya que estos últimos son de crecimiento lento.
Como su nombre lo indica, estos medios de cultivo contienen sustancias nutritivas, como fuentes de vitaminas, aminoácidos, nitrógeno y carbono, entre ellos se pueden mencionar: extracto de carne o extracto de levadura, almidón de maíz, digerido pancreático, peptonas, glucosa, entre otros.
Además contienen otros componentes que le brindan al medio un equilibrio osmótico, pues la mayoría de los cultivos requieren un pH cercano a 7,0. Estos elementos pueden ser: cloruro de sodio, fosfato disódico, entre otros.
El diluyente es agua destilada y los medios sólidos poseen agar-agar.
La finalidad de estos medios de cultivo es recuperar la microbiota bacteriana o fúngica que exista en una muestra determinada. No discrimina entre microorganismos, pues en él es capaz de crecer una gran cantidad de bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas, así como también hongos levaduriformes y miceliales.
Se recomiendan para sembrar muestras que provienen de sitios normalmente estériles. Sin embargo, no sirven para microorganismos exigentes.
También son útiles para el mantenimiento de cepas, siempre y cuando no contengan glucosa.
Si se les agrega sangre o sangre calentada a los medios simples nutritivo, se convierten en medios enriquecidos (agar sangre y agar chocolate respectivamente).
Estos medios son muy útiles para sembrar muestras que normalmente son estériles, para rescatar cepas que se encuentran débiles y para aislar microorganismos exigentes desde el punto de vista nutricional.
Los medios de cultivo selectivos además de contener nutrientes esenciales para el crecimiento de ciertos microorganismos de interés, también se le adicionan sustancias inhibidoras, tales como antibióticos, antifúngicos, colorantes, sales biliares, entre otros.
Las sustancias inhibidoras tienen la finalidad de reducir la variedad de cepas que puedan crecer, favoreciéndose el crecimiento de un grupo particularmente especial que se quiere rescatar.
Ejemplo: caldo EC (especial para coliformes totales y fecales) o agar Sabouraud con antibióticos (específico para hongos).
Los medios diferenciales contienen elementos nutricionales necesarios para el crecimiento de un grupo específico de microorganismos y además contiene sustancias que en presencia de ciertos microorganismos serán metabolizados o degradados.
Es decir, producirán reacciones químicas que de una u otra manera será evidenciada en el medio de cultivo.
Algunas reacciones alcalinizan o acidifican el medio y gracias a la presencia de un indicador de pH, estos cambios se pueden evidenciar a través de un viraje de color en el medio y de la colonia.
Por tanto, entre un gran grupo de bacterias que podrán crecer en ese medio se distinguirán las que metabolizan o degradan la sustancia y los que no lo hacen, simplemente observando el color de la colonia y del medio.
Por ejemplo, el agar sangre permite distinguir las bacterias que producen hemólisis beta (halo transparente) de las que producen hemólisis alfa (halo verdoso) y de las que no producen hemólisis.
Un ejemplo de ello es lo que ocurre en el agar MacConkey. Es selectivo ya que permite únicamente el crecimiento de bacilos Gram negativos; y es diferencial, ya que en él se pueden distinguir las bacterias fermentadoras de lactosa (colonias color fucsia) de las no fermentadoras (color rosado pálido o incoloro).
Como su nombre indica, son medios utilizados para transportar muestras que han sido tomada en un lugar más o menos lejano al laboratorio que procesará la muestra. El medio de trasporte conserva la muestra en las mejores condiciones para que se obtengan resultados confiables.
Estos medios de cultivo tienen características muy especiales, pues no pueden excederse en nutrientes, ya que se requiere que la población bacteriana que se encuentra presente se mantenga viable, pero sin que aumenten en número.
Por lo general son medios semisólidos, lo que permite que la muestra se mantenga hidratada. Sin embargo, no debe escatimarse en hacer llegar la muestra lo más pronto posible al laboratorio. Ejemplos de medios de transporte: medio Stuart, Cary Blair y Amies.
Estos medios de cultivo son líquidos. Se utilizan para rescatar patógenos específicos que en un momento dado puedan estar presentes en una muestra en mínima cantidad.
También es útil para rescatar una cepa patógena que pueda estar débil por algún tratamiento previo recibido. Ej: agua peptonada, caldo tioglicolato y caldo selenito.
Estos medios tienen sustancias inhibidoras que evitan el crecimiento de la microbiota acompañante, y nutrientes específicos que favorecen el desarrollo del microorganismo de interés.
Estos medios poseen sustancias que pueden ser metabolizadas químicamente por ciertas bacterias, produciendo reacciones químicas que evidencian la presencia de enzimas o vías metabólicas específicas.
Por tanto, son usadas como pruebas bioquímicas que ayudan al reconocimiento del género y de la especie de un grupo de cepas en particular. Ej: El medio Kligler evidencia si el microorganismo es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa, si produce sulfuro de hidrógeno y gas.
Este medio contiene sustancias reveladoras que permiten observar la reacción, tal como el indicador de pH, y los iones de hierro.
Esta simple prueba puede diferenciar dos grandes grupos de microorganismos bacterianos, como son las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae de las bacterias denominadas no fermentadores.
Estos son medios simples, no selectivos que sirven para la cuantificación de una población microbiana, como por ejemplo el medio cuenta estándar. El tipo de microorganismo que crecerá en este medio dependerá de las condiciones de temperatura y de oxígeno que se establezcan.
El medio estandarizado para tal fin es el agar Müeller Hinton, este medio es ideal para evaluar el comportamiento de los diferentes antibióticos frente a un microorganismo patógeno aislado.
Es especialmente útil en bacterias poco exigente, mientras que en bacterias exigentes solo se puede utilizar si este es suplementado con sangre.
Estos medios tienen como finalidad reproducir al microorganismo y además mantener en un mayor tiempo posible la viabilidad de la bacteria u hongo y además que se preserven sus funciones fisiológicas.
Una característica importante es que este tipo de medio no debe contener glucosa, pues si bien es un elemento que proporciona un crecimiento rápido, también su fermentación produce ácidos que disminuyen la vida del microorganismo.
Algunos laboratorios necesitan mantener viables a ciertos microorganismos para ser utilizados posteriormente en estudios de investigación, controles internos o para fines docentes.
En la actualidad existen muchas marcas comerciales que distribuyen los diferentes medios de cultivo. Los medios vienen en forma liofilizada o deshidratada, contenidos en frascos herméticos y protegidos de la luz.
Cada medio trae una etiqueta donde se especifica el nombre del medio, sus componentes, número de lote y cuánto hay que pesar para preparar un litro de medio de cultivo.
Como diluyente se utiliza agua destilada. La cantidad pesada se disuelve en un litro de agua destilada hasta que la mezcla quede homogeneizada. La mayoría de los medios se llevan al autoclave, a 15 libras de presión, 121°C de temperatura, por 15 minutos de tiempo.
Los medios líquidos se autoclavan ya distribuidos en sus respectivos tubos de trabajo, mientras que los medios sólidos se autoclavan en matraces Erlenmeyer.
Estos últimos se dejan reposar hasta que alcancen una temperatura de 55°C y se sirve en las placas de Petri dentro de una campana de flujo laminar o cerca del mechero de Bunsen. Se dejan solidificar y se guardan en nevera de forma invertida.
También existen medios de cultivo sólidos que se distribuyen en tubos, dejándose solidificar bien sea en tacos (rectos) o en pico de flauta (inclinados).
Antes de utilizar cualquier medio de cultivo preparado, bien sea sólido o líquido, este debe atemperarse antes de sembrar la muestra.
Los medios de cultivo sin duda alguna son una herramienta de trabajo muy valiosa para los microbiólogos, pues estos hacen posible la recuperación del agente infeccioso que en un determinado momento pueda estar afectando a un individuo o contaminando un alimento, un ambiente o una superficie.
En este sentido, se puede decir que la microbiología tiene diversos campos, entre ellos está la microbiología clínica, industrial, ambiental, de alimento, entre otras y en todas se utilizan los medios de cultivo.
Por supuesto, el tipo de medio utilizado en cada caso puede variar de acuerdo a las necesidades y al tipo de muestra procesada. También influye el grupo de microorganismo buscado.
El aislamiento del microorganismo patógeno o causante de alguna contaminación es indispensable para poder colocar un tratamiento efectivo o adoptar procedimientos que ayuden a eliminar al contaminante en cuestión.
En el caso de la microbiología clínica, no solo es importante aislar al microorganismo e identificarlo (conocer género y especie), sino que además se debe realizar el antibiograma.
Este estudio que también utiliza un medio de cultivo, permitirá decir qué antimicrobiano es sensible y cuál es resistente o en pocas palabras, cuál se puede utilizar como tratamiento y cuál no.
Por tanto, los medios de cultivo en general no pueden faltar en un laboratorio de microbiología, sea cual sea el área.
Finalmente, se puede decir que los medios de cultivo han permitido investigar diversos aspectos, tanto de las bacterias como de los hongos.
La preparación y uso de los medios de cultivo no debe realizarse a la ligera. En cada laboratorio debe haber un departamento que aplique protocolos de control de calidad a los medios, cada vez que se preparan lotes nuevos, y así garantizar que están debidamente preparados, estériles y funcionales.
Para evaluar su esterilidad, se toman al azar uno o dos medios de cada lote y se incuban a 37 °C por varios días (no debe existir crecimiento). Para comprobar su función se utilizan cepas de referencia ATCC (American Type Culture Collection) debidamente cultivadas y viables.
Después de usar los medios de cultivo, estos deben ser descartados de tal manera que no contamine al medio ambiente.
Para ello, el material se esteriliza en autoclave antes de que sea desechado. Posteriormente, se retira el material de la cristalería. Esta última pasa a ser lavada, secada, esterilizada y guardada para su posterior uso. En caso de usar placas desechables estas se esterilizan y posteriormente se desechan en bolsas especiales.
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