Frotis bacteriano: características y preparación
El frotis bacteriano es una extensión en forma de película delgada de una suspensión de microorganismos bacterianos que se efectúa sobre una placa de vidrio transparente o portaobjetos, para su observación bajo un microscopio óptico.
La extensión en forma de película se efectúa con el objeto de separar los microorganismos en lo posible, ya que si están agrupados la observación no es nítida.
En el estudio de cultivos bacterianos se emplean técnicas de preparación de frotis, de fijación y de coloración para analizarlos mejor. A causa del tamaño tan pequeño de los microorganismos, se requiere necesariamente el uso de un microscopio óptico para su observación.
Los microscopios ópticos son instrumentos indispensables para la observación de los frotis. Estos emplean lentes ópticas y luz permitiendo la visualización de las muestras con gran aumento del tamaño.
En general, las células vivas no tienen estructuras mayormente coloreadas, vistas al microscopio óptico son muestras incoloras, transparentes, y muestran muy poco contraste interno y con su entorno.
La observación con el microscopio óptico sencillo de campo claro, sin el uso de técnicas auxiliares de tinción, está muy limitada y solo se utiliza en algunos casos, como en la observación del movimiento de microorganismos.
Para la observación de los microorganismos de manera óptima, es preciso lograr un balance entre el contraste y la resolución. Los detalles de las células no pueden observarse al microscopio, aún con alta resolución; se requiere el uso de colorantes a través de técnicas de tinción, que aporten contraste para la observación.
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Para lograr un excelente contraste existen microscopios sofisticados llamados microscopio de contraste de fases, de interferencia diferencial y microscopio de campo oscuro. Este tipo de microscopio se utiliza para observar estructuras bacterianas como vainas y filamentos, entre otras.
La tinción es una técnica sencilla para aumentar el contraste que se logra con un microscopio de campo claro. En esta técnica pueden emplearse diferentes colorantes que mejoran notablemente la observación al microscopio.
Las tinciones se efectúan directamente sobre los frotis o extensiones de las suspensiones de microorganismos sobre los portaobjetos, previamente secados y fijados.
La fijación es una técnica que se utiliza para preservar las estructuras celulares; provoca inactivación de los microorganismos y adhesión al vidrio del portaobjetos. Existen diferentes tratamientos de fijación: la fijación por calor y la fijación química.
Fijación por calor
Este es el método más utilizado en la observación de frotis bacteriano. La técnica consiste en pasar la suspensión bacteriana del frotis por la llama de un mechero. Esta técnica es capaz de preservar la morfología externa de las bacterias, pero destruye sus estructuras internas.
Fijación química
La fijación química emplea sustancias químicas en la preservación, tales como el formaldehido o formol, el etanol y el ácido acético, entre otros. La ventaja de emplear agentes químicos fijadores, es que se logra la preservación de las estructuras celulares internas de los microorganismos.
Los procedimientos más comunes para efectuar la tinción de un frotis previamente secado y fijado son la tinción positiva o simple, la tinción diferencial y la tinción negativa. Existen también técnicas especiales para tinción de estructuras celulares particulares (de cápsula, de esporas, de flagelos).
Tinción positiva o tinción simple
La tinción positiva o simple es la técnica de tinción de frotis más empleada. Utiliza colorantes que tienen la capacidad de unirse a ciertas estructuras microbianas, permitiendo observarlas al microscopio.
Estos colorantes poseen grupos cromóforos (porción coloreada) en su estructura química, con enlaces dobles alternados y enlaces sencillos (conjugación). Estos enlaces pueden a su vez establecer enlaces iónicos o covalentes con algunas estructuras celulares.
Los colorantes empleados en la tinción positiva o simple son en su mayoría derivados químicos de la anilina (sales orgánicas coloreadas).
Por otra parte, entre los colorantes podemos encontrar algunos con pH básico y otros con pH ácido.
Colorantes básicos
En los colorantes básicos, el grupo cromóforo posee carga eléctrica positiva. La gran mayoría de los microorganismos procariotas poseen un pH interno neutro, y su superficie celular tiene carga negativa. A través de esta interacción electrostática, el cromóforo se une a la célula y la tiñe.
Ejemplos de colorantes básicos son el azul de metileno, el cristal violeta, el verde malaquita, la fuscina básica, la safranina, entre otros.
Colorantes ácidos
En los colorantes ácidos el grupo cromóforo posee carga eléctrica negativa. Estos se emplean para la tinción de proteínas con grupos amino de carga positiva. Ejemplos de colorantes ácidos son la fuscina ácida, la rosa de Bengala, el rojo Congo y la eosina.
Tinción diferencial
La técnica de tinción diferencial consiste en aplicar dos colorantes de distinto color o intensidad, para distinguir microorganismos diferentes al microscopio. La tinción de Gram y la tinción de resistencia ácido-alcohol, son las tinciones diferenciales más empleadas en bacteriología.
La tinción de Gram se emplea como prueba preliminar para conocer la forma, el tamaño, agrupación celular, además del tipo de pared celular. Mediante la prueba de tinción de Gram, las bacterias con pared celular se clasifican en bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas.
Tinción negativa
En esta técnica se emplean colorantes químicos que no penetran al interior celular, pero hacen que el medio en el que están los microorganismos aparezca como un fondo negro.
En la técnica de tinción negativa, el frotis se elabora con una gota de suspensión de tinta china o de nigrosina, que después de permitir el secado a temperatura ambiente forma una película opaca al paso de la luz. De esta manera, los microorganismos se observan como formas brillantes sobre un fondo oscuro.
1.- Lavar muy bien los portaobjetos, secar con papel absorbente y rotularlos. El rótulo debe señalar contenido de la preparación, fecha y nombre de quien la ha procesado.
2.- Encender el mechero y esterilizar el asa de inoculación en la llama hasta rojo vivo.
3.- Dejar enfriar el asa.
4.- Tomar el tubo del cultivo bacteriano, retirar el tapón y rápidamente pasar la boca del tubo cerca de la llama del mechero (flamear).
5.- Introducir el asa de inoculación dentro del tubo que contiene el cultivo bacteriano y tomar la muestra.
6.- Si el cultivo está en medio líquido, colocar la muestra tomada con el asa en el centro del portaobjetos y extenderla con cuidado en un círculo de aproximadamente 2 cm de diámetro.
7.- Esterilizar de nuevo el asa de inoculación.
8.- Permitir el secado del frotis al aire.
9.- Repetir los pasos del 3 al 8 tres veces.
10.- Si el cultivo está en medio sólido, se debe colocar previamente en el portaobjetos una gota de agua destilada. Esto se hace para mezclar una pequeña muestra del cultivo tomada con el asa de inoculación, según las indicaciones de los pasos 2 a 5 (condiciones de asepsia).
11.- Extender la muestra diluida con la gota de agua sobre el portaobjetos y repetir tres veces.
1.- Añadir a los frotis secos -provenientes de cultivos en medio líquido-, dos gotas de metanol o etanol absoluto.
2.- Permitir secado al aire lejos del mechero.
3.- Si el frotis proviene de un cultivo en medio sólido, el fijado del frotis seco se efectúa con calor, pasándolo 2 a 3 veces rápidamente por la zona más caliente de la llama del mechero.
4.- Tocar la parte inferior del frotis con la parte dorsal de la mano izquierda (para diestros; caso contrario, emplear mano derecha) y verificar que esté frío.
1.- Adicionar al frotis 2 gotas del colorante seleccionado y dejar actuar por el tiempo requerido en los protocolos específicos de cada colorante (generalmente entre 1 y 5 minutos).
2.- Algunos colorantes requieren uso de calor para su activación, en cuyo caso hay que ser muy cuidadoso al calentar el portaobjetos en la llama del mechero (manipularlo con pinzas y evitar la ebullición). Un sobrecalentamiento del frotis puede destruir las células que se desean observar.
3.- Retirar el exceso de colorante lavando con agua destilada de una piceta. Eliminar el agua de lavado, golpeando suavemente el portaobjetos por su canto, inclinado sobre la mesa de trabajo.
4.- Permitir secado al aire.
5.- Dependiendo del tipo de observación, se usa o no un cubreobjetos en esta etapa. El cubreobjetos protege y preserva al frotis. Si se efectúa una observación por inmersión en aceite en esta etapa, no se usa cubreobjetos pero el frotis no se podrá preservar.
1.- Sumergir el frotis sucesivamente en cada una de las soluciones señaladas a continuación, por un mínimo de 5 minutos. La finalidad de estos “baños” es dejar completamente deshidratado al frotis. Se debe escurrir bien cada reactivo, antes de introducir el frotis en el siguiente baño.
El orden de los baños deshidratantes es el siguiente:
- Etanol 70 %
- Etanol 95 %
- Acetona pura
- Mezcla acetona –xilol 1:1
- Xilol
Luego permitir el secado al aire.
2.- Montar el cubreobjetos, preferiblemente de 22×22 mm, utilizando bálsamo de Canadá u otro medio para montaje.
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