Agar chocolate: fundamento, usos y preparación
El agar chocolate es un medio de cultivo sólido, enriquecido, no selectivo y no diferencial. Es utilizado principalmente para el aislamiento de microorganismos exigentes desde el punto de vista nutricional, aunque en él pueden crecer cualquier tipo de bacterias.
Es por ello que su utilidad aumenta especialmente en el sembrado de muestras que normalmente son estériles, como LCR y líquido articular. Aunque también se incluye dentro de los medios escogidos para siembras de muestras polimicrobianas, pero en estos casos es necesario la adición de antibióticos que inhiban la flora concomitante.
Este medio posee un color marrón característico muy parecido al chocolate, de allí su nombre. La preparación es muy similar a la del agar sangre, solo que en este caso la sangre debe ser calentada con la finalidad de que los glóbulos rojos se rompan.
Su preparación, al igual que el agar sangre, es muy delicada, pues es fácilmente contaminable. Por ello muchos laboratorios prefieren adquirir este medio ya preparado por casas comerciales que garantizan su calidad.
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Este medio está compuesto por una base de agar rico en nutrientes y sangre calentada. La hemólisis de los glóbulos rojos proporcionan al medio factor X (hemina) y factor V (NAD), necesarios para el crecimiento de algunos microorganismos, como el género Haemophilus. También es muy útil para el aislamiento de Neisserias sp.
Al igual que el agar sangre, se puede usar como agar base diferentes medios dependiendo de la necesidad. Entre los medios utilizados se encuentran infusión cerebro corazón y agar soja tripticasa, aunque los más recomendados son agar Columbia, Müeller Hinton, agar GC y agar Thayer Martin.
Algunas variantes de agar chocolate incluyen un suplemento enriquecido disponible comercialmente llamado Isovitalex o Polivitex.
Estos suplementos contienen vitamina B12, L-glutamina, adenina, clorhidrato de guanina, ácido p-aminobenzoico, nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), pirofosfato de tiamina, nitrato férrico, clorhidrato de tiamina, hidrocloruro de cisteína, L-cistina y glucosa.
Es importante resaltar que el agar chocolate es más enriquecido que el agar sangre, pero no permite la observación de los patrones de hemólisis.
Este medio contiene digerido pancreático de caseína y de corazón, digerido péptico de carne, cloruro de sodio, agar, extracto de levadura y almidón de maíz. Además es rico en vitaminas, minerales y amino ácidos esenciales.
Esta base con sangre calentada es ideal para el aislamiento de bacterias del género Neisseria. Por otra parte, si al medio adicionalmente se le añade un suplemento para Brucella se puede aislar al mencionado microorganismo. Se mejoran los resultados usando sangre de caballo.
Este medio contiene peptonas, almidón de maíz, buffers monobásicos y dibásicos, cloruro de sodio y agar.
La mayoría de las presentaciones de agar chocolate preparados comercialmente vienen con esta base y no contienen sangre calentada, sino una mezcla sintética de hemina y un suplemento químico de factores de crecimiento, vitaminas, minerales, aminoácidos, factor V y glucosa.
Se usa para realizar la prueba de susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos exigentes, como Streptococcus pneumoniae usando 5% de sangre de carnero calentada.
También sirve para el aislamiento primario de Neisserias y Haemophilus, pero en el caso particular del aislamiento de Haemophilus se prefiere el uso de sangre de caballo, por ser una fuente rica en factor X y V.
Por otra parte, si la muestra a sembrar proviene de un área no estéril es recomendable la adición de antibióticos para inhibir la flora normal del área.
Ejemplo para muestras respiratorias donde se sospeche la presencia de bacterias del género Haemophilus se usa bacitracina para inhibir el crecimiento de Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus y Neisserias saprófitas.
En el caso de muestras de chancros genitales, donde se sospecha de Haemophilus ducreyi, se ha usado con éxito un agar chocolate preparado de la siguiente manera: agar Müeller – Hinton con 5% de sangre chocolatizada de caballo, 1% de enriquecimiento Isovitalex y 3 µg/ml de vancomicina.
Este medio es especial para el aislamiento de Neisseria gonorrhoeae. El mismo debe contener antibióticos para inhibir la flora acompañante. Se usa sangre de cordero.
Se deben ver las indicaciones de preparación del agar base que se va a utilizar. Las mismas se encuentran al reverso del envase del medio deshidratado. Generalmente describen cuánto se debe pesar para preparar un litro de medio de cultivo.
En el laboratorio se puede preparar la cantidad exacta necesaria, puede ser más o menos de un litro.
Se realiza una regla de tres para calcular cuánto se debe pesar para preparar el volumen que se desea. Ejemplo:
Si para 1 litro se necesita pesar 40 gr y el laboratorio requiere 800 ml, se dice:
1000 ml ———————————40 gr
800 ml ———————————– X
La fórmula quedará de la siguiente manera:
X= 32 gr (cantidad a pesar para 800 ml).
Se procede a pesar la cantidad necesaria y se coloca en una fiola con el agua.
Se calienta a fuego moderado y se va mezclando suavemente con movimientos rotatorios hasta disolver completamente el medio deshidratado, dejando hervir por 1 minuto.
Se introduce la fiola en el autoclave para esterilizar el medio a 121°C por 20 minutos.
Al salir del autoclave se deja reposar hasta que la temperatura del medio esté aproximadamente entre 56 a 70°C para colocar la sangre y mezclar hasta que el medio se torne color marrón.
Si se va a agregar suplementos, este es el momento de hacerlo. Posteriormente mezclar y servir 20 ml a cada placa de Petri estéril.
Todo el procedimiento se debe realizar en una campana de flujo laminar o alrededor del mechero de Bunsen.
Dejar reposar hasta que se solidifiquen y guardar de forma invertida en nevera.
Se prepara el medio base como se describió anteriormente, se disuelve la hemoglobina deshidratada obtenida comercialmente y se esteriliza en el autoclave.
Ambas soluciones se dejan enfriar a 50 °C, se unen y se agrega el suplemento. Mezclar en condiciones asépticas y luego servir en placas de Petri estériles.
Es importante que la sangre se coloque a la temperatura indicada, pues es la ideal para lisar los glóbulos rojos y a la vez mantener el factor V que es termosensible.
No deben quedar burbujas sobre la superficie del agar. De cada lote de 100 placas se debe incubar una o dos placas en la estufa a 37°C durante 24 horas para comprobar su esterilidad.
Para mejores resultados, el agar chocolate debe ser usado al poco tiempo de su preparación.
Se deben tener en el laboratorio cepas bacterianas controles para evaluar la eficacia del medio recién preparado para el crecimiento de los principales microorganismos exigentes de importancia clínica.
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- Wikipedia contributors. Chocolate agar. Wikipedia, The Free Encyclopedia. December 17, 2018, 19:54 UTC. Available at: en.wikipedia.org.