Cromatografía en columna: tipos, fundamentos, aplicaciones
¿Qué es la cromatografía en columna?
La cromatografía en columna es una técnica que permite la separación de los componentes de una mezcla de sustancias, con la finalidad de lograr la purificación de una sustancia determinada para su identificación, caracterización o utilización.
La cromatografía en columna tiene dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil. La fase estacionaria puede encontrarse en fase sólida o líquida y las sustancias a ser separadas interaccionan con ella, previamente o simultáneamente a la acción de la fase móvil.
La fase móvil, en cambio, se desplaza durante la cromatografía y permite la separación de los componentes de la mezcla. La fase móvil puede encontrarse en estado líquido o gaseoso, e interacciona con las sustancias en la cromatografía por semejanza en sus polaridades.
La cromatografía en columna es una técnica versátil que tiene numerosas aplicaciones en varias industrias, así como en la medicina. Por lo tanto, las técnicas cromatográficas han evolucionado constantemente: tal es el caso de la llamada cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
La HPLC permite analizar, en un tiempo muy corto, numerosas sustancias, ya que todas las etapas del proceso están automatizadas. Por ejemplo, resulta de gran utilidad en sinfines de análisis de calidad de fármacos, donde deben analizarse muchas muestras diariamente.
Asimismo tenemos la cromatografía por exclusión de tamaño, la cual, como su nombre lo indica, se fundamenta en el tamaño de las moléculas y no tanto en sus polaridades. Esta técnica se utiliza cuando se requiere separar mezclas de pigmentos, resinas, asfaltenos, biomoléculas, etc., que no difieren demasiado en su naturaleza química.
Tipos de cromatografía en columna
Existen varios tipos de cromatografía que se realizan en columna, estructura de vidrio u otro material, generalmente en forma de tubos rectos. Entre los tipos de cromatografía en columna están los siguientes:
- Absorción o de columna.
- Partición líquido-líquido.
- Intercambio iónico.
- Exclusión por tamaño.
- Gas.
- Líquida de Alta Resolución (HPLC).
- Afinidad.
Fundamentos y materiales
Cromatografía de adsorción o cromatografía de columna
Esta cromatografía tiene los mismos principios que la cromatografía en capa fina, basándose en el uso de una fase estacionaria sólida de naturaleza polar (alúmina o sílice gel), y una fase móvil constituida por un solvente no polar en estado líquido.
Las sustancias polares presentes en una mezcla de sustancias, interaccionan con la fase estacionaria polar y son adsorbidas por esta. Además, tienen poca afinidad por el solvente no polar de la fase móvil.
Mientras, las sustancias de baja polaridad se separan fácilmente de su unión con la fase estacionaria debido a su polaridad; lo cual, les permite interaccionar en mayor grado con la fase móvil no polar y ser desplazadas por ella.
Cromatografía de partición líquido-líquido
Este término se usa para denominar un tipo de cromatografía en la cual la fase estacionaria y la fase móvil se encuentran en estado líquido. La fase estacionaria es un líquido polar que impregna un soporte sólido, usualmente sílice inerte. Y la fase móvil, corresponde a un líquido no polar.
Este arreglo de las fases en la cromatografía de partición se denomina como fase normal, mientras que si el líquido no polar impregna a la sílice, constituyendo la fase estacionaria, se denominará entonces cromatografía de partición en fase reversa.
Cromatografía de intercambio iónico
En este tipo de cromatografía la fase estacionaria está cargada eléctricamente. Cuando su carga es positiva, retiene a los aniones (-); y si la carga es negativa, a los cationes (+).
Se suelen utilizar como fase estacionaria aminas, ácido sulfónico, tierra de diatomea, celulosa y sephadex (obtenido del dextrano). A estos últimos materiales se les adicionan una carga positiva, por ejemplo, dietilaminoetil (DEAE) para obtener la DEAE-celulosa o el DEAE-sephadex, para interaccionar así con los aniones.
También se les puede adicionar una carga negativa mediante la unión del grupo carboximetil (CM), para formar así CM-celulosa o CM-sephadex, los cuales funcionan como intercambiadores catiónicos.
Las interacciones electrostáticas existentes en este tipo de cromatografía se pueden regular mediante modificaciones del pH y la fuerza iónica del líquido que forma la fase móvil.
A pH neutro o básico, las proteínas suelen estar cargadas negativamente e interaccionan con la carga positiva de la DEAE-celulosa y el DEAE-sephadex; pero al disminuir el pH de la fase móvil, las proteínas pueden volverse positivas y dejar de interaccionar con la carga positiva de la fase estacionaria.
Usando esta estrategia experimental, se pueden ir separando las diferentes proteínas presentes en una mezcla.
Asimismo, se utilizan en la cromatografía de intercambio iónico compuestos inorgánicos tales como los aluminosilicatos (zeolitas).
Cromatografía de exclusión por tamaño
Este tipo de cromatografía se basa en la existencia de partículas que presentan en su interior canales, los cuales permiten la circulación de una sustancia de pequeño tamaño y de bajo peso molecular a través de ellos. Mientras, las sustancias de mayor tamaño no pueden atravesar los canales y son excluidas de ellos.
Aunque parezca extraño, las sustancias de mayor tamaño se desplazan por la fase móvil con mayor facilidad que las de menor tamaño, ya que no son retenidas en los canales de las partículas usadas en la cromatografía. Entre estas partículas están la zeolita y el sephadex.
El llamado sephadex fue creado por la compañía Pharmacia a partir del polisacárido dextrano. Existen muchos tipos de sephadex cuyo uso se selecciona con base al tamaño o peso molecular de las sustancias que se desean separar.
Cromatografía de gas
En esta cromatografía la fase estacionaria recubre la pared de las columnas o rellena su interior, mientras la fase móvil la constituye un gas inerte: nitrógeno o helio. Las columnas de la cromatografía son de vidrio o de metal; aunque actualmente tienen formas estrechas de capilares, cuyas paredes están revestidas de sílice.
Las columnas de cromatografía tienen una longitud entre 1 metro y 100 metros, estando las columnas dentro de un horno capaz de suministrar temperaturas superiores a 300 ºC. Las sustancias utilizadas en la cromatografía deben ser volátiles, ya que deben evaporarse durante la cromatografía.
Las sustancias se evaporan de la superficie de la fase estacionaria de acuerdo a su punto de ebullición. La evaporación de las sustancias ocurre en función del incremento de la temperatura del horno, lo que permite que las sustancias alcancen su punto de ebullición en forma secuencial.
Una vez alcanzado su punto de ebullición, las sustancias se evaporan y son arrastradas por la corriente del gas inerte al sistema de detección y análisis.
La técnica de cromatografía de gases es básicamente analítica y no preparativa. Es decir, no suele utilizarse para la obtención de una determinada sustancia.
Cromatografía de alta resolución (HPLC)
Los fundamentos de HPLC son semejantes a los de llamada cromatografía de columna o de adsorción, pero la diferencia es que el solvente (fase móvil) pasa a través de la fase estacionaria, impulsado por una presión de alrededor de 400 atmósferas.
Las columnas de HPLC tienen una longitud comprendida entre 15 y 25 cm, y un diámetro interno de 0.46 cm. Suelen estar hechas de acero inoxidable. La fase estacionaria la forman partículas muy pequeñas de sílice que tienen una característica polar.
Fase normal
En la fase normal de HPLC, se suele usar un solvente no polar como fase móvil, usualmente hexano. Las sustancias polares interaccionan con el sílice y emergen tardíamente de las columnas de cromatografía. Mientras, las sustancias no polares tienen mayor afinidad por los solventes no polares, no interaccionan con las partículas de sílice y emergen por lo tanto rápidamente de las columnas.
Fase reversa
En la llamada fase reversa, las partículas polares de sílice son transformadas en no polares por la adición de una cadena de hidrocarburos de 8 a 18 carbonos. En la fase móvil, se usa un solvente polar formado por una mezcla de metanol y agua.
Las sustancias polares no interaccionan con las partículas de sílice modificadas (no polares) pero sí interaccionan con el solvente polar, permitiendo que salgan rápidamente de la columna de cromatografía, siendo llevadas a un sistema de detección con la presencia de luz ultravioleta.
Cromatografía de afinidad
Esta cromatografía se basa en la interacción de una sustancia en particular con un ligando para ella, fijado a un soporte que puede ser agarosa, dextrano, celulosa, etc. La cromatografía de afinidad es una técnica usada para la separación y purificación de moléculas con una función biológica.
La técnica de cromatografía de afinidad permite la purificación de una proteína, usando para ello un anticuerpo específico fijado a un soporte, el cual constituye la fase estacionaria. El cobre, el cobalto y el níquel son usados como ligando para obtener proteínas que contienen el aminoácido histidina.
También se utiliza esta técnica para la purificación de DNA y RNA, usando como ligando un ácido nucleico con una secuencia de bases complementaria. La sustancia unida a su ligando puede ser separada modificando el pH, o la fuerza iónica de la solución que se usa como fase móvil.
Aplicaciones
La cromatografía en columna es una técnica usada para la separación de una sustancia de una mezcla de ellas, con diferentes fines u objetivos. Por ejemplo: el diagnóstico de un problema, la identificación de fármacos, la obtención de una sustancia, etc.
La cromatografía de adsorción se utiliza en la eliminación de las impurezas de sustancias, en el aislamiento de metabolitos de líquidos biológicos, en la determinación en alimentos de ácidos orgánicos perjudiciales, etc.
La cromatografía líquida de alta resolución es una técnica que tiene numerosos usos, entre ellos: en la detección de antibióticos, sedantes, esteroides u otros de interés farmacológicos; en la identificación de agentes contaminantes como pesticidas, herbicidas, fenoles, etc.
La cromatografía de gases se usa en el estudio de muchas sustancias volátiles. Es utilizada en la industria farmacéutica en el análisis de fármacos, como la aspirina, el ibuprofeno, y el paracetamol. Además de la identificación en la orina de agentes dopantes, como anfetaminas, cocaína, LSD, cannabis, etc.
La cromatografía de exclusión por tamaño y la cromatografía de afinidad son utilizadas principalmente en el aislamiento y purificación de macromoléculas biológicas, como proteínas y ácidos nucleicos.
Y finalmente, la cromatografía de intercambio iónico se utiliza en la purificación de proteínas y polipéptidos.
Referencias
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