DAPI (4’, 6-diamidino-2-fenilindol): características, fundamento, uso
El DAPI (4’, 6-diamidino-2-fenilindol) es un colorante que por su propiedad fluorescente sirve como marcador, siendo muy utilizado en la técnica de microscopía de fluorescencia o citometría de flujo, entre otras. La fluorescencia que emite es de color azul brillante, su excitación se produce entre 455-461 nm (luz UV).
El colorante DAPI puede atravesar la membrana celular de las células muertas con gran facilidad. También puede teñir los núcleos de células vivas, pero en este caso, la concentración de este debe ser mayor.
El colorante es capaz de acceder al ADN celular por el que tiene una especial afinidad, uniéndose con gran avidez a las bases nitrogenadas adenina y timina. Por este motivo es de gran utilidad en algunas técnicas de biología molecular.
Este compuesto pertenece al grupo de los colorantes indólicos y ha demostrado tener mayor sensibilidad por el ADN que el bromuro de etidio y el yoduro de propidio, especialmente sobre geles de agarosa.
El uso de este colorante fluorescente es muy amplio, pues es útil para: estudiar cambios en el ADN en los procesos apoptóticos (muerte celular) y por tanto detectar células en este proceso; para la foto footprinting de ADN (impresión fotográfica del ADN); para estudiar la contaminación bacteriana; o para visualizar la segmentación nuclear.
También se ha utilizado en el estudio de bandas cromosómicas, en la detección de ADN de Mycoplasmas sp, en la interacción ADN-proteína, en la tinción y contaje de células por inmunofluorescencia e inclusive para colorear granos maduros de polen.
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DAPI es la abreviación de su nombre químico (4’, 6-diamidino-2-fenilindol). Su fórmula molecular es C16H15N5. Posee un peso molecular de 350,3. Cerca del rango de luz UV (345 a 358 nm) ocurre la excitación máxima del complejo DAPI-ADN, mientras que la emisión de fluorescencia máxima ocurre entre 455-461 nm.
Este colorante se caracteriza por ser un polvo de color amarillo, pero las estructuras marcadas con este fluoróforo emiten una luz azul brillante.
Es un compuesto soluble en agua, sin embargo, para acelerar su disolución se puede aplicar algo de calor. Se puede diluir con PBS pero no disolver directamente en este.
Una vez preparado el colorante, este debe ser almacenado en oscuridad, es decir, protegido de la luz, a una temperatura de 2 a 8 °C (nevera). Bajo estas condiciones, el colorante es estable por más de 3 semanas o meses.
Si se resguarda de la luz pero se deja a temperatura ambiente su estabilidad baja a 2 o 3 semanas, pero expuesto a luz directa el deterioro es muy rápido. Si se desea guardar por mucho más tiempo se puede refrigerar a -20 °C distribuido en alícuotas.
Esta coloración se fundamenta en generar una contratinción nuclear en las principales técnicas de biología molecular, tales como: citometría de flujo, microscopía de fluorescencia y tinción de cromosomas metafásicos o núcleos interfásicos, entre otros.
Esta técnica se basa en la gran afinidad que tiene el colorante por las bases nitrogenadas (adenina y timina) contenidas en el material genético (ADN) en el surco menor. Mientras que a nivel citoplasmático deja muy poco fondo.
Cuando ocurre la unión del colorante fluorescente a las regiones de adenina y timina del ADN, la fluorescencia aumenta significativamente (20 veces más). El color que emite es azul brillante. Cabe destacar que no hay emisión de fluorescencia cuando se une a los pares de bases GC (guanina-citosina).
Es importante resaltar que aunque también tiene afinidad por el ARN, esta no causa problema, debido a que el mayor grado de emisión de energía de esta molécula ocurre a otra longitud de onda (500 nm), a diferencia del ADN que lo hace a 460 nm. Además el aumento de fluorescencia una vez unido al ARN es de solo 20%.
El DAPI se usa más para teñir células muertas (fijadas) que vivas, ya que para teñir a estas últimas se necesita una concentración mucho más alta del colorante, esto se debe a que la membrana celular es mucho menos permeable al DAPI cuando está viva.
El colorante DAPI se puede usar en combinación con fluoróforos rojos y verdes para así obtener una experiencia multicolor.
El DAPI (4’, 6-diamidino-2-fenilindol) es un excelente fluoróforo y por tanto es ampliamente utilizado en diversas técnicas y para diversos propósitos. A continuación se explica el uso de DAPI en las principales técnicas.
Los investigadores Gohde, Schumann y Zante en 1978 fueron los primeros en utilizar y proponer el DAPI como fluoróforo en la técnica de citometría de flujo, teniendo un gran éxito debido a su alta sensibilidad por el ADN y su alta intensidad en la emisión de fluorescencia.
El uso de DAPI en esta técnica, permite el estudio del ciclo celular, la cuantificación de células y la tinción de células vivas y muertas.
Aunque existen otros colorantes, tales como el bromuro de etidio, el óxido de Hoechst, el naranja de la acridina y el yoduro de propidio, el DAPI es uno de los más utilizados por ser más fotoestable que los anteriormente mencionados.
Para esta técnica se requiere fijar las células, para ello puede usarse etanol absoluto o paraformaldehído al 4%. La muestra se centrifuga y se desecha el sobrenadante, posteriormente se hidratan las células adicionando 5 ml de solución amortiguadora PBS por 15 minutos.
Mientras transcurre el tiempo prepare el colorante DAPI con un tampón de tinción (FOXP3 de BioLegend) a una concentración de 3 µM.
Centrifugue la muestra, deseche el sobrenadante y posteriormente cubra con 1 ml de solución DAPI por 15 minutos a temperatura ambiente.
Llevar la muestra al citómetro de flujo con el láser adecuado.
Otra técnica en la que se utiliza el DAPI es en la micro-fluorometría de flujo junto con otro fluoróforo llamado mitramicina. Ambos son útiles para cuantificar el ADN de cloroplasto de forma individual, pero DAPI es el más indicado para medir partículas de bacteriófagos T4.
Esta técnica básicamente utiliza sondas de ADN marcadas con un colorante fluorescente que puede ser el DAPI.
La muestra requiere ser tratada con calor para desnaturalizar el ADN bicatenario y convertirla en dos cadenas monocatenarias. Posteriormente se hibrida con una sonda de ADN desnaturalizado marcado con DAPI que posee una secuencia de interés.
Posteriormente se lava para eliminar lo que no se hibridó, se utiliza un contraste para visualizar el ADN. El microscopio de fluorescencia, permite la observación de la sonda hibridada.
Esta técnica tiene la finalidad de detectar secuencias específicas en el ADN cromosómico, pudiendo hacer el diagnóstico de determinadas enfermedades.
Estas técnicas cito-moleculares han sido de gran ayuda para determinar detalles en el estudio de los cariotipos. Por ejemplo, ha evidenciado las regiones ricas en pares de bases de adenosina y timina denominadas regiones heterocromáticas o bandas DAPI.
Esta técnica es muy utilizada para el estudio de cromosomas y cromatina en plantas y animales, así como también en el diagnóstico de patologías prenatales y hematológicas en el humano.
En esta técnica, la concentración de DAPI recomendada es de 150 ng/ml por un tiempo de 15 minutos.
Los portaobjetos ya montados deben guardarse protegidos de la luz a 2-8 °C.
Las células se fijan con paraformaldehído al 4%. Si se van a utilizar otros colorantes se deja DAPI al final como contratinción y se cubren las células con solución PBS por 15 minutos. Mientras transcurre el tiempo, prepare la solución DAPI diluyendo con PBS, de tal manera que la concentración final sea 300 µM.
Luego se extrae el PBS sobrante y se cubre con DAPI por 5 minutos. Se lava varias veces. La lámina se observa en un microscopio de fluorescencia bajo el filtro adecuado.
Este compuesto debe ser manipulado con cuidado, debido a que es un compuesto que tiene propiedades mutagénicas. El carbón activado es utilizado para eliminar a este compuesto de soluciones acuosas que van a ser descartadas.
Debe utilizarse guantes, bata y lentes de seguridad para evitar accidentes con este reactivo. Si ocurre contacto con piel o mucosas debe lavar el área con suficiente agua.
Jamás debe pipetear este reactivo con la boca, utilice propipetas.
No contamine el reactivo con agentes microbianos, ya que ello se traducirá en resultados erróneos.
No diluya el colorante DAPI más de lo recomendado, porque disminuirá considerablemente la calidad de la tinción.
No exponga el reactivo a la luz directa, ni conserve en calor porque ello disminuye la fluorescencia.
- Brammer S, Toniazzo C and Poersch L. Corantes comúnmente empregados na citogenética vegetal. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Available from: scielo.
- Laboratorios Impath. DAPI. Disponible en:menarinidiagnostics.com/
- Laboratorios Cytocell. 2019. Instructions for use of DAPI. available at cytocell.com
- Elosegi A, Sabater S. Conceptos y técnicas en ecología fluvial. (2009). Editorial Rubes, España. Disponible en: books.google.co.ve/
- Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Uso de fluorescencia en un método de disector modificado para estimar el número de miocitos en el tejido cardíaco. Arq. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Available from: scielo.
- Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Presencia de fitoplasmas en papayo (Carica papaya) en México. Revista Chapingo. Serie horticultura, 2011; 17 (1), 47-50. Disponible en: scielo.org.