Agar citrato de Simmons: fundamento, preparación y uso
El agar Citrato de Simmons es un medio sólido utilizado como prueba bioquímica de identificación de microorganismos, especialmente de bacilos Gram negativos. El medio original fue creado por Koser en 1923.
El medio Citrato de Koser consistía en un caldo que contenía fosfato de sodio, fosfato de amonio, fosfato monopotásico, sulfato de magnesio y citrato de sodio.
Como puede verse, la única fuente de carbono del medio es el citrato, y de nitrógeno es el fosfato de amonio, omitiéndose las proteínas y los carbohidratos como fuente de estos elementos, comúnmente están presentes en otros medios.
Por tanto, la bacteria inoculada en ese medio solo puede reproducirse si es capaz de tomar el carbono del citrato. La prueba era positiva si había turbidez en el medio, sin embargo tenía el inconveniente de que podía ocurrir turbidez no específica.
Este problema fue resuelto por Simmons agregándole agar y azul de bromotimol a la fórmula original de Koser. Aunque el principio es el mismo, se interpreta de forma diferente.
Índice del artículo
Algunas bacterias tienen la capacidad de sobrevivir en ausencia de fermentación o producción de ácido láctico, necesitando conseguir energía a través de la utilización de otros sustratos. En esta prueba la única fuente de carbono ofrecida es el citrato.
Las bacterias que son capaces de sobrevivir bajo estas condiciones metabolizan el citrato de forma rápida por una vía alterna a la tradicional, utilizando el ciclo del ácido tricarboxílico o el ciclo de fermentación del citrato.
El catabolismo del citrato por parte de las bacterias comprende un mecanismo enzimático sin la intervención de la coenzima A. Esta enzima se conoce con el nombre de citricasa (citrato oxalacetato-liasa) o citrato desmolasa. La reacción requiere la presencia de un catión bivalente, que en ese caso es suministrado por el magnesio.
La reacción genera oxaloacetato y piruvato, que luego dan origen a ácidos orgánicos en medio de un pH alcalino formado por la utilización de la fuente de nitrógeno. Estos ácidos orgánicos son usados como fuente de carbono generando carbonatos y bicarbonatos, alcalinizando aun más el medio.
El medio citrato de Simmons debe ser ligeramente inoculado en cola de pescado usando ansa recta o aguja, e incubarse durante 24 horas a 35-37°C. Culminado el tiempo se observan los resultados.
El sembrado se realiza únicamente en la superficie del agar. No hacer punción.
Si el medio queda del color original (verde) y no hay crecimiento visible, la prueba es negativa, pero si el medio cambia a color azul, indica la presencia de productos alcalinos, que es detectado por el indicador de pH. En este caso la prueba es positiva.
Esto sucede porque si la bacteria utiliza el carbono del citrato también es capaz de tomar el nitrógeno del fosfato de amonio con el cual libera amoníaco, alcalinizando el medio.
Por otra parte, si se observa crecimiento de la bacteria en el medio, pero no hay cambio de color, también la prueba debe considerarse positiva, ya que si hay crecimiento quiere decir que la bacteria fue capaz de utilizar el citrato como fuente de carbono, aunque no haya un cambio del pH en el momento (en ocasiones puede tardar).
Si existe duda en la interpretación del color final, se puede comparar con un tubo de citrato no inoculado.
Pesar 24,2 gr del medio deshidratado para un litro de agua. Mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos aproximadamente. Terminar de disolver el medio calentando durante 1 o dos minutos, agitando frecuentemente.
Servir 4 ml en tubos de ensayo y autoclavar a 121°C durante 15 minutos. Al salir del autoclave, inclinar con ayuda de un soporte de tal manera que el agar se solidifique en forma de pico de flauta con poco taco o fondo y más bisel.
El pH final del medio citrato es de 6,9 (color verde). Este medio es muy sensible al cambio de pH.
A pH 6 o por debajo, el medio se torna color amarillo. Este color no es observado en la prueba con bacterias.
Y a pH 7,6 o por encima, el medio cambia a color azul de prusia intenso.
El agar citrato de Simmons es usado para la identificación de ciertos microorganismos, en especial los bacilos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae y otros bacilos no fermentadores de glucosa.
El medio citrato de Simmons es una prueba muy delicada, pues se pueden obtener falsos positivos si se cometen ciertos errores.
Los cuidados que se deben tener son los siguientes:
No se debe hacer un inoculo bacteriano muy grueso o cargado, pues el mismo puede ocasionar que se desarrolle un color amarillo cobrizo en el lugar del sembrado, sin afectar el resto del medio, pero puede hacer creer que hay crecimiento. El mismo no significa positividad de la prueba.
Así mismo, un inóculo espeso puede generar un falso positivo, debido a que los compuestos orgánicos preformados dentro de las paredes celulares de bacterias moribundas pueden liberar suficiente carbono y nitrógeno para hacer virar el indicador de pH.
Por ello, lo ideal es sembrar usando la aguja en lugar del asa de platino, para evitar tomar exceso de material.
Por otra parte, cuando se está sembrando la batería de pruebas bioquímicas para la identificación del microorganismo en cuestión, es importante que la prueba del citrato sea la primera en inocularse, para evitar el arrastre de proteínas o carbohidratos de otro medio.
Bajo esta circunstancia es posible obtener un falso positivo, debido a que cualquiera de estas sustancias que se introduzcan por error será metabolizada y provocará un cambio del pH.
Otra manera de evitar el arrastre de sustancias es quemar bien el asa y tomar nuevo inoculo entre una prueba y otra.
También se debe tener cuidado al tocar la colonia para realizar el inoculo, pues debe evitarse arrastrar parte del agar del cultivo del cual provienen las bacterias, debido a lo anteriormente explicado.
En este sentido, Matsen, Sherris y Branson recomiendan diluir el inoculo en solución fisiológica antes de inocular la prueba del citrato para evitar el traslado de otras fuentes de carbono.
Debe tenerse en cuenta que la intensidad del color producido cuando la prueba es positiva puede variar de acuerdo a la casa comercial.
Además, hay microorganismos que dan positivo a las 24 horas, pero hay otras cepas que requieren 48 horas o más para producir un cambio del pH.
- Mac Faddin J. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. 3era ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
- Laboratorios BD. BBL Simmons Citrate Agar Slants. 2015. Disponible en: bd.com
- Laboratorios Britania. Simmons Citrate Agar. 2015. Disponible en: britanialab.com
- Laboratorios Valtek Diagnostic. Agar Citrato de Simmons. 2016. Disponible en: andinamedica.com.