Preparación de medios de cultivo: qué son, objetivos, tipos, pasos
¿Qué es la preparación de medios de cultivo?
La preparación de medios de cultivos es una metodología de rutina usada en los laboratorios para el crecimiento de microorganismos deseados. Los medios de cultivo son preparaciones sólidas, líquidas o semi-sólidas que poseen todos los nutrientes necesarios para el desarrollo de una población microbiana.
De manera general, los medios para cultivar microorganismos son ricos en proteínas y aminoácidos y suelen contener algún componente que favorezca el crecimiento del organismo que se desea estudiar, como vitaminas, sangre, suero, entre otros.
No existe un medio de cultivo general o universal, ya que la composición del mismo varía en función de las necesidades del microorganismo de interés. Algunas bacterias pueden desarrollarse en cualquier medio de cultivo, pero otras poseen requerimientos especiales.
¿En qué consiste?
Los microorganismos, como los hongos y las bacterias, no pueden ser estudiados de manera individual por su tamaño microscópico. Por ello se deben cultivar en medios artificiales que permitan el aumento significativo de la población.
Por ejemplo, si queremos estudiar bacterias tenemos que proporcionarles las condiciones adecuadas para que puedan proliferar y forman una colonia (que puede ser observada a simple vista).
La preparación de los medios de cultivo varía ampliamente dependiendo del tipo de microorganismo que se desea cultivar. Antes de prepararlo, es menester conocer las necesidades nutricionales básicas del organismo de trabajo.
A continuación se describirán los componentes más habituales usados en los medios de cultivos para tener una idea general de su preparación:
Agar
Se usa en los cultivos como agente gelificante y se añade cuando se busca un medio sólido o semisólido. El primer agente solidificante usado en la preparación de medios fue la gelatina, pero en 1883 el agar fue introducido en el mundo de la bacteriología por W. Hesse.
El agar de tipo bacteriológico posee como componente principal un polisacárido de complejas ramificaciones, extraído de algas. Este compuesto es usado como espesante de alimentos comunes, como helados y mermeladas.
Es un elemento muy valioso en la microbiología por varias razones. Principalmente, porque los microorganismos no pueden degradarlo, se licúa a una temperatura de 100° C y permanece en estado líquido hasta alcanzar unos 45° C o menos.
En caso de que se quiera preparar un medio sólido, la concentración de agar debe estar alrededor de 1,5%, mientras que los semisólidos deben ser preparados desde 0,3 hasta 0,5%.
Fluidos
El cultivo de organismos patógenos necesita de fluidos corporales para que puedan desarrollarse como lo harían en su ambiente natural.
Por esta razón, se añade sangre completa o desfibrilada. El fluido se extrae de un animal sano y, una vez esterilizado, se agrega en el medio de cultivo.
Extractos
Son obtenidos de distintas partes animales (como carne o hígado) o vegetales (semillas) y se procesa para obtener un concentrado sólido en forma de pasta o polvo.
Los más comunes son los extractos de levadura, malta y carne.
Peptonas
Estos compuestos orgánicos se obtienen por hidrólisis enzimática o química de tejidos animales o vegetales. La finalidad es añadir contenido rico en aminoácidos, los cuales son las unidades fundamentales de las proteínas.
Amortiguadores
Los “buffers”, o sistemas amortiguadores, evitan los cambios bruscos de pH y ayudan a mantener el rango óptimo que el organismo tolera.
La mayoría de los organismos pueden desarrollarse adecuadamente a un pH de 7, aunque algunas bacterias prefieren los medios alcalinos. Sin embargo, existen bacterias que resisten variaciones de pH entre los valores de 6 y 9.
En especies sensibles al pH, el daño no es producido por la cantidad excesiva de iones hidrógeno o hidroxilo, sino por el aumento de ácidos o bases débiles que pueden penetrar en la célula.
Igualmente, se añaden indicadores de pH para poder monitorearlo y evitar desviaciones ocasionadas por fermentaciones u otros procesos.
Objetivos
El objetivo principal al preparar un medio de cultivo es añadir todos los componentes necesarios para permitir el desarrollo exitoso del organismo que desea ser aislado. Debe ser identificada la combinación de componentes y nutrientes más efectivo para lograr el medio deseado.
Tanto la preparación como el almacenamiento del medio son críticos para garantizar un crecimiento exitoso, ya que de estos pasos depende la composición del medio y la disponibilidad de nutrientes.
Hay que tomar en cuenta que el cultivo de microorganismos es una tarea que se ve afectada por varios factores externos al medio de cultivo, como la intensidad de luz recibida, temperatura y nivel de acidez o alcalinidad del medio.
Por ello, cada una de estas variables debe ser tomada en cuenta y vigilada rigurosamente.
Tipos de medios
Basados en su composición
Basados en su composición existen tres tipos principales de cultivos: naturales o empíricos, semi-sintéticos y medios definidos sintéticos o químicos.
Medio natural
En los medios naturales la composición exacta es desconocida. Estos incluyen ingredientes como leche, sangre diluida, zumos vegetales, extractos e infusiones de carnes y peptonas.
Por razones económicas, suelen añadirse componentes de bajo costo, como extracto de soya, suero, melaza, etc.
Medios semi-sintéticos
Se llama medio semi-sintético si se conoce parcialmente la composición del mismo. Cualquier medio que contenga agar pasa a ser un medio semi-sintético.
Entre ellos tenemos agar papa dextrosa, agar czapek-dox, agar avena, agar peptona de carne, entre otros ejemplos.
Medio definidos sintéticos o químicos
En este caso la composición del medio –en cuanto a la cantidad de fuentes de carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y cualquier otro factor de crecimiento necesite– es totalmente conocida.
Es muy útil si se quieren obtener resultados reproducibles para otros investigadores.
Para los llamados “microorganismos con requerimientos especiales de crecimiento” se necesita añadir los componentes necesarios. Un ejemplo de este tipo son los Lactobacillus.
Basada en el tipo de microorganismo
Del mismo modo, existe otra clasificación para los medios de cultivo basada en el tipo de microorganismo que puede crecer en él.
Siguiendo este principio tenemos los siguientes: medios generales, de enriquecimiento, selectivos y diferenciales. Cada uno se describe a continuación:
Medios generales
Estos admiten el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos. Si algún organismo necesita de condiciones especiales para su crecimiento no podrá desarrollarse exitosamente en este tipo de cultivo.
Medios de enriquecimiento
Los medios de enriquecimiento favorecen el crecimiento de cierto tipo de microorganismo, pero no se ha añadido ninguna sustancia para evitar que otra clase de microbios crezcan en él.
Medios selectivos
Buscan el crecimiento específico de un microorganismo, llámense hongos, bacterias, protozoarios, entre otros. Para ello, inhiben el desarrollo de los demás.
Para lograr este objetivo se pueden añadir compuestos químicos mortales para un amplio grupo de microorganismos e inocuo para el organismo de interés, o añadiendo fuentes de energía que solo sean asimilables por el microbio buscado.
Los medios selectivos son utilizados cuando se toman muestras médicas con el fin de cultivar algún microorganismo patógeno. Acá es necesario favorecer el crecimiento del patógeno e inhibir el desarrollo de la flora microbiana normal proveniente del paciente.
El agar sulfito de bismuto, por ejemplo, no permite el crecimiento de bacterias grampositivas y una gran cantidad de bacterias encontradas en la cavidad gastrointestinal.
Por ello, es usado para cultivar la bacteria gramnegativa causante de la fiebre tifoidea, Salmonella typhi, en muestras fecales.
Medios diferenciales
Este tipo utiliza alguna característica diagnóstica del organismo de interés (peculiaridades en su metabolismo, por ejemplo) para poder identificarlas frente a otra especie que crece en el mismo medio.
Tanto los medios diferenciales como los medios selectivos son de gran utilidad en el área de la microbiología clínica y de la salud pública, ya que estas disciplinas necesitan detectar la presencia de microorganismos específicos relacionados con patologías o condiciones pobres de higiene.
Se pueden añadir sustancias indicadoras en el cultivo que otorguen una característica distintiva a la colonia buscada. Por ejemplo, a los medio agar-eosina-azul de metileno (abreviado EMB) y el agar-MacConkey se les añade lactosa y un indicador de pH.
Así, cuando se desarrolla una colonia en estos medios con la capacidad de fermentar la lactosa y de producir aldehídos, pueden observarse de un color especial.
Pasos para la preparación de medios de cultivo
Actualmente los medios de cultivo pueden comprarse en forma liofilizada. Por ello, la preparación se facilita y solamente queda rehidratar el producto.
El contenido debe ser pesado (tomando en cuenta la cantidad final que se desea preparar) y disuelto en agua destilada siguiendo todas las indicaciones del producto.
El contenido de los medios líquidos debe ser dividido en los recipientes deseados (placas de Petri, tubos, etc) para su posterior esterilización.
Para distribuir el medio sólido es necesario fundirlo usando un microondas o sometiendo el material a un baño María. El pH del medio debe ser ajustado.
Usualmente el agar se usa en tubos de ensayo o en placas de Petri. Si el agar solidifica en una posición inclinada, con el ángulo adecuado para que el borde terminal final sea diagonal, a esta disposición se le conoce como tubos en pico de flauta o inclinados.
Cuando el agar solidifica en posición totalmente vertical se le da el nombre de “profundo”.
Tras esterilizar los medios –usando una autoclave– se dejan enfriar. Estos deben ser manipulados en un ambiente libre de microorganismos, lo más común es trabajar con un mechero encendido que asegura un ambiente aséptico en sus cercanías.
Referencias
- Celis, J. E. (2006). Cell biology: a laboratory handbook (Vol. 2). Elsevier.
- Finegold, S. M., Bailey, W. R., Baron, E. J., Fineglod, S. M., & Scott, E. G. (1991). Bailey Scott: diagnóstico microbiológico. Médica Panamericana.
- Olivas, E. (2004). Manual de Prácticas de Microbiología I y II y Parasitología. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez.
- Schlegel, H. G., & Zaborosch, C. (1993). General microbiology. Cambridge University Press.
- Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007). Introducción a la microbiología. Ed. Médica Panamericana.