Orceína: fundamento y preparación
La orceína es un colorante natural de color púrpura, extraído de diversos líquenes como: orchilla o urchilla, liquen fruticoso, Rocella tinctoria y Lecanora parella principalmente. La Rocella tinctoria se encuentra en el continente africano y americano, aunque puede ser remplazada por otras especies ubicadas en Europa.
Este colorante ha sido ampliamente usado en los estudios citogenéticos desde la antigüedad. En este sentido, la preparación de orceína que incluye ácido acético, fue introducida por LaCourt en 1941, por lo que se le denominó inicialmente como la técnica de LaCourt.
Así mismo, por su sencillez y bajo costo ha sido utilizado para la fabricación de tornasol (colorante extraído de líquenes) y en estudios histológicos (tinción de células y tejidos).
Diversos estudios han empleado esta tinción combinada con otros químicos, como el picrocarminato amoniacal y el ácido acético, para teñir las fibras elásticas y cromosomas respectivamente. En la actualidad, la orceína sigue siendo empleada en los estudios citogenéticos de animales y vegetales.
Recientemente, Silva y col. 2017 emplearon con éxito esta tinción para observar los diversos cambios que ocurren en las fibras elásticas de la piel del dedo pulgar en adultos mayores chilenos. Este estudio reveló como se alteran las fibras del dedo pulgar con el envejecimiento.
En este sentido, las fibras elásticas se observaron de color pardo-negruzco en los individuos mayores de 80 años; mientras que en los más jóvenes (desde 60 años) se aprecian de color pardo rojizo. El citoplasma y otras estructuras de las células se tornan verde amarillento.
Esto permitió corroborar la presencia y el estado de las fibras elásticas, en cuanto a su disposición, cantidad e integridad. Por otra parte, también se ha señalado que la orceína es de gran ayuda para identificar aneurismas y diagnosticar arteritis, entre otras afecciones.
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La orceína forma parte del grupo de colorantes oxazina y la tinción se fundamenta en su afinidad por el ADN. El colorante se une a la carga negativa de esta molécula, representada por el grupo fosfato. Es por ello que, los cromosomas se tiñen de color morado.
No obstante, el resto de las estructuras de la célula toman otro color. Específicamente, en el caso de las fibras elásticas, estas se colorean de un color pardo rojizo, los núcleos celulares desde un azul a violeta oscuro, mientras que el colágeno no se tiñe.
Por esto, la orceína es utilizada para teñir la cromatina y diferenciar el sexo en algunas especies de moscas. Así mismo, se pueden colorear los núcleos y algunas inclusiones hepáticas producidas por los antígenos de la hepatitis B.
Las soluciones de orceína tienen funciones específicas en la tinción. La orceína A, tiene como función reblandecer las membranas de las células, causando su muerte y paralizando el proceso de división de las mismas. Mientras, la orceína B es la encargada de completar la coloración por su adhesión a los cromosomas.
Para preparar una solución al 1% de aceto-orceína, se disuelven 2 gramos de orceína en 45 ml de ácido acético glacial, preferiblemente caliente y se le agregan 55 ml de agua destilada a temperatura ambiente.
Luego, se mezcla constantemente para homogeneizar la disolución, para posteriormente dejar reposar hasta que se enfríe. Por último, se almacena a 4ºC en frascos oscuros. Esta preparación fue empleada por Flores 2012, para la observación de las fases de maduración de los ovocitos de vaca.
En este caso, por ejemplo, se coloca la solución de aceto-orceína sobre el tejido previamente fijado en ácido acético-etanol por 24 horas. Este proceso de tinción se realiza por 30 minutos y posteriormente el tejido es sometido a decoloración.
Así mismo, esta se puede emplear en la identificación de organelos en tejidos multicelulares. En este caso se tiñe un frotis de la mucosa bucal con una gota de la solución de aceto-orceína, se le coloca el cubreobjetos a la lámina e inmediatamente puede observarse el núcleo de la célula con sus subestructuras.
Adicionalmente, la orceína se puede preparar con otros químicos como el ácido láctico y el ácido propiónico. Para ello, se disuelve un gramo de orceína en una solución premezclada a temperatura ambiente de 23 ml de ácido láctico y 23 ml de ácido propiónico; completando el volumen con agua destilada hasta 100 ml.
Con esta solución lacto-propiónico orceína se puede observar las distintas fases de división meiótica de las células vegetales. En este caso, la muestra previamente prefijada e hidrolizada se coloca durante 15 minutos en la solución lacto-propiónico orceína y luego se extiende el tejido en láminas portaobjetos.
En el estudio de Duque 2016 sobre los cromosomas politénicos, este empleó una preparación de 2 gramos de orceína diluida en ácido acético y ácido láctico al 85%, diluyendo con una solución de ácido acético al 65%. Finalmente, observó los cromosomas en las glándulas salivares de la Drosophila melanogaster.
Es importante tener en cuenta que dependiendo de la muestra y lo que se desea evaluar, se prepara la solución de orceína adecuada. Así por ejemplo, a la solución de la orceína A se le adiciona ácido clorhídrico 1N, para la observación de las células en división.
Mientras que la solución de la orceína B, se termina disolviendo en ácido acético al 45%. Esta técnica constituye un método abreviado de tinción y, por lo general, se usa como complemento de la coloración de las estructuras cromosómicas.
Desde los siglos pasados, en países del continente americano como Argentina se pueden conseguir líquenes como: Lecanora, Parmelia y Umbilicaria, que son grandes fuentes de orceína. También zonas europeas como las Islas Canarias, fueron en su momento grandes productoras de la orchilla.
Esta era exportada a otras ciudades de este mismo continente como Génova y países como Inglaterra, mientras Holanda, monopolizaba la fabricación del tornasol a partir de la orchilla. Por lo que posteriormente se redujo este liquen hasta estar a punto de extinguirse.
Esto condujo a que la orchilla fuera sustituida por otras plantas con propiedades tintóreas. Sin embargo, el surgimiento de los colorantes sintéticos contribuyó con la finalización del comercio de este liquen fuente de orceína.
Esto fue posible gracias a Cocq, quién en el año 1812 describió la síntesis de la orceína, conociéndose entonces que esta es sintetizada por un compuesto fenólico denominado orcinol. Sin embargo, a pesar de esto actualmente la orceína natural sigue siendo la preferida.
Esto puede deberse a que el orcinol es un compuesto de olor muy fuerte y cuya exposición prolongada podría conllevar riesgos de salud, como la pérdida de la capacidad de detectar olores. Estos daños a la pituitaria podrían pasar de temporales a permanentes mientras mayor sea la exposición.
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