Caldo lactosado: fundamento, preparación y usos
El caldo lactosado es un medio de cultivo líquido, no selectivo, utilizado principalmente como medio de pre-enriquecimiento en el aislamiento de cepas de Salmonella provenientes del análisis microbiológico realizado a alimentos procesados, productos lácteos o agua. Así lo recomienda la International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMPF).
El medio contiene digerido enzimático de gelatina, extracto de carne y lactosa, sustancias necesarias para el crecimiento bacteriano. Además la lactosa es un carbohidrato fermentable, por tanto algunos coliformes son capaces de desdoblarlo con la producción de gas.
Por eso, el caldo lactosado es recomendado por la American Public Health Association (APHA) para el estudio presuntivo de bacterias coliformes totales y fecales, calificándolo como una excelente alternativa para sustituir el caldo lauril sulfato triptosa en la técnica estándar del Número Más Probable (NMP), utilizada para el análisis microbiológico de muestras de alimentos, leche y aguas superficiales, subterráneas, recreacionales, residuales domésticas e industriales.
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Para el análisis microbiológico de algunas muestras el paso del pre-enriquecimiento es esencial para poder recuperar un microorganismo específico que pueda estar en muy baja cantidad o en condiciones no favorables que vulneran o minimizan su viabilidad.
Tal es el caso de los alimentos secos y procesados, posiblemente contaminados con Salmonellas sp. En estos casos, si las bacterias están presentes han sufrido un maltrato físico y químico durante el proceso de producción del producto.
De tal forma que los microorganismos son expuestos a factores adversos como la deshidratación, exposición a productos inhibitorios o tóxicos, y al solapamiento generado por la presencia de otras bacterias en mayor cantidad, entre otros.
En este sentido, el caldo lactosado tiene un efecto reparador de las estructuras dañadas del microorganismo, haciendo que el mismo se recupere y se reproduzca, de tal manera de que pueda ser detectado.
Así mismo, el caldo lactosado tiene la capacidad de diluir las sustancias inhibitorias que puedan afectar su viabilidad, permitiendo su desarrollo. Además, la composición nutricional del caldo lactosado es estratégica para favorecer el crecimiento de Salmonella sp por encima de otros microorganismos.
Para la identificación final, se debe sub-cultivar hacia otros medios de cultivos definitivos.
Por otra parte, la composición del medio también permite detectar microorganismos fermentadores de lactosa que producen gas.
Para preparar un litro de caldo lactosado se deben pesar 13 gramos del medio deshidratado y disolver en 1000 ml de agua destilada.
Para ayudar a la disolución del medio en el agua se puede calentar un poco la solución, pero no demasiado.
Una vez homogénea, la solución se prepara de la siguiente manera: si el caldo se utilizará para la búsqueda de coliformes, se prepara una gradilla con tubos de ensayo, al cual se le introduce un tubo de fermentación de Durham boca abajo.
El tubo de Durham es un detalle muy importante, porque el mismo permitirá detectar la formación de gas, dato de gran valor en la búsqueda de coliformes.
Preparados los tubos, se dispensan 10 ml del caldo lactosado en los mismos, cantidad que debe ser suficiente para cubrir la totalidad del tubo Durham.
Si el caldo lactosado va a ser utilizado como caldo de pre-enriquecimiento, no es necesario colocar tubo de fermentación de Durham. En este caso, se requiere mayor cantidad de medio (225 ml), el cual será servido en frascos de 500 ml, boca ancha y con tapa de rosca termo-resistente.
Posteriormente, los tubos o los frascos se llevan al autoclave a 121°C por 15 minutos.
El medio debe quedar a un pH final de 6.9 ± 0.2 a 25°C.
Los caldos se guardan en nevera hasta su uso.
Antes de usarse deben atemperarse los caldos a temperatura ambiente.
Por otra parte, el caldo lactosado también puede ser preparado a doble concentración.
Algunos laboratorios agregan púrpura de bromocresol al caldo lactosado como indicador de pH, para evidenciar los tubos donde ha habido fermentación de la lactosa por el cambio de color. En este caso el caldo toma un color morado y si hay fermentación vira a amarillo.
En los laboratorios de microbiología el caldo lactosado es muy utilizado por ser un medio relativamente económico que ofrece resultados fiables y rápidos (24-48 horas).
Se puede utilizar para el análisis de coliformes totales y fecales en agua y alimentos o como caldo de pre-enriquecimiento para Salmonella.
El pre-enriquecimiento es un paso previo al enriquecimiento de la muestra, que mejora enormemente la recuperación de bacterias del género Salmonella en alimentos procesados.
Para ello, se siembra la muestra del alimento sólido (25 gramos) o líquido (25 ml) en 225 ml de caldo lactosado, incubándose durante 24 a 48 horas. Posteriormente se sub-cultivará en un medio enriquecido como caldo selenito cistina o caldo tetrationato. Luego pasa a medios selectivos XLD y SS.
Es un medio excelente como indicador de contaminación fecal.
Por ello, el caldo lactosado es ideal para la fase presuntiva del estudio de coliformes por el método del Número Más Probable.
Para muestras en la que se sospecha gran cantidad de coliformes se inoculará menor cantidad de la misma (1ml), mientras que para muestras en la que se sospecha menor cantidad de coliformes se inocula más volumen de muestras (10 ml).
Para el análisis se hacen diluciones 10-1, 10-2, 10-3, formando una batería de 3-5 tubos para cada concentración utilizada.
De cada dilución se siembra un mismo volumen a los caldos lactosados.
Los tubos se incuban durante 24 horas. Los caldos que resulten negativos se incuban durante 24 horas más.
La interpretación de los resultados se hace por la observación de dos características: la primera es la presencia o ausencia de turbidez y como este medio no contiene indicador de pH, no habrá cambio de color.
La segunda es la producción o no de gas. El gas se evidencia fácilmente en el tubo de Durham, por la aparición de una o varias burbujas de aire en su interior.
Se considera positivo si se observan ambas características, es decir, turbidez con producción de gas. Los tubos positivos deben ser resembrados en medios confirmatorios (caldo Verde Brillante Bilis al 2 % y caldo EC).
– En la preparación del medio es importante no olvidar colocar los tubos Durhams si el propósito del mismo es el estudio de coliformes.
– No sobrecalentar el medio antes de esterilizar.
– Distribuir en los tubos de ensayo antes de esterilizar, nunca después.
– No usar si el medio tiene más de 3 meses de preparado.
– No usar si observa algún cambio de las características habituales del medio.
– Al preparar un lote de caldo lactosado, pruebe la calidad del mismo sembrando cepas conocidas como Escherichia coli, Enterobacter aerogenes , Citrobacter freundiiyKlebsiella pneumoniae. Los mismos crecen muy bien, con producción de gas (control positivo).
– También puede incluir Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium o Enterococcus faecalis, que crecen bien, pero sin producción de gas (Control negativo).
– Se debe estar pendiente que el color original del medio deshidratado es beige y el del medio preparado amarillo muy claro y transparente. Si se observa cambio en el color o en el aspecto, puede existir deterioro del mismo.
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