Agar verde brillante: fundamento, preparación y usos
El agar verde brillante es un medio de cultivo sólido, con alto grado de selectividad. Se utiliza exclusivamente para el aislamiento de cepas del género Salmonella, sin embargo existen algunas excepciones, como la especie typhi y paratyphi que no crecen en este medio.
La búsqueda del género Salmonella es frecuente en muestras de heces, agua o alimentos. En este sentido, este medio puede ser de gran utilidad. Este agar fue creado en 1925 por Kristensen, Lester y Jurgens, más tarde fue modificado por Kauffmann.
Está compuesto por pluripeptonas provenientes de digerido péptico de tejido animal y digerido pancreático de caseína, además contiene extracto de levaduras, cloruro de sodio, lactosa, sacarosa, rojo fenol, verde brillante y agar-agar.
Se caracteriza por ser un medio bastante inhóspito para la mayoría de las bacterias, favoreciendo el crecimiento de Salmonella, sin embargo algunos coliformes son capaces de subsistir en el mismo, desarrollándose débilmente.
Es importante destacar que en este medio no crece el género Shigella y tampoco Salmonella typhimurium, ni Salmonella paratyphi. Por tanto, si se desea aislar a estos microorganismos se deben usar otros medios, como el agar XLD, entre otros.
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Cada uno de los componentes que conforman el medio cumple una función específica que determinan las características y propiedades del agar.
Las pluripeptonas y el extracto de levadura son la fuente de nutrientes de donde los microorganismos toman el nitrógeno y los minerales necesarios para su desarrollo. La lactosa y la sacarosa son fuentes de energía para los microorganismos que son capaces de fermentarlas.
El verde brillante es la sustancia inhibidora que impide el desarrollo de las bacterias Gram positivas y un gran número de microorganismos Gram negativos.
El cloruro de sodio brinda estabilidad osmótica al medio. Mientras que el rojo de fenol es el indicador de pH, el mismo vira de color al detectar la producción de ácidos proveniente de la fermentación de los carbohidratos.
Las colonias no fermentadoras de lactosa y sacarosa crecen en este medio de un color blanco rosadas o trasparentes, sobre un fondo rojo. Por ejemplo, bacterias del género Salmonella.
En tanto que las bacterias fermentadoras de lactosa o sacarosa capaces de crecer en este medio, desarrollan colonias de color amarillo verdosas o verde amarillentas, sobre un fondo amarillo verdoso. Por ejemplo, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae.
Existen otras variantes del agar verde brillante; el agar novobiocina verde brillante glucosa (NBG) y el agar novobiocina verde brillante glicerol lactosa (NBGL).
El agar novobiocina verde brillante glucosa(NBG)
Contiene agar tripticasa de soja, citrato férrico de amonio, tiosulfato de sodio pentahidratado, rojo fenol, glucosa, verde brillante, novobiocina y agua destilada.
Sirve para el aislamiento de colonias de Salmonella a partir de muestras de heces.
En este caso el verde brillante y la novobiocina son las sustancias inhibidoras que impiden el crecimiento de las bacterias Gram positivas y algunos microorganismos Gram negativos.
El tiosulfato de sodio es la fuente de sulfuro y el citrato férrico es la fuente de hierro, ambas necesarias para revelar la producción de sulfuro de hidrógeno a través de la formación de un precipitado negro de sulfuro férrico.
La glucosa es el carbohidrato fermentable y el rojo de fenol es el indicador de pH.
En este medio las colonias de Salmonella se desarrollan grandes con centro negro rodeada de un halo rojizo y seguida por una zona visible clara. Algunas cepas de Citrobacter freundii producen colonias idénticas a la de Salmonella.
El agar novobiocina verde brillante glicerol lactosa (NBGL)
Este medio contiene agar tripticasa de soja, citrato férrico de amonio, tiosulfato de sodio, lactosa, glicerol, verde brillante, novobiocina y agua destilada.
La diferencia de este medio con el anterior es que se sustituye la glucosa por lactosa y glicerol y no se usa rojo de fenol.
El medio igualmente se usa para aislar especies de Salmonella, las colonias se desarrollan de color negro, por la producción de sulfuro de hidrógeno.
Solo las colonias que no producen ácido a partir del glicerol o la lactosa logran una producción de H2S suficiente, porque el pH bajo interfiere con la formación de H2S. Esto da como resultado colonias sin color para la mayoría de las especies de Proteus y Citrobacter.
-Pese 58 gramos del medio deshidratado obtenido comercialmente. Agréguelo en un litro de agua bidestilada. Mezcle, deje reposar unos minutos y someta la preparación a una fuente de calor hasta que se disuelva completamente.
-Autoclave a 121°C por 15 minutos, no sobrepase el tiempo de esterilización.
-Dejar reposar y servir aun caliente en placas de Petri estériles. El pH final debe quedar en 6,9 ± 0,2.
-Dejar solidificar y guardar en nevera hasta su uso. Antes de sembrar las placas deben tomar temperatura ambiente.
-El medio en polvo es de color verde y preparado toma un color anaranjado-marrón o rojizo verdoso, dependiendo del pH y de la casa comercial. Un color muy pardo es indicativo que el agar fue sobrecalentado.
-Una vez solidificado el agar no se recomienda refundir, pues el medio se deteriora.
Este medio es usado para la búsqueda de cepas del género Salmonella de muestras de heces y alimentos lácteos, entre otros.
Por ser un medio bastante inhóspito, es recomendable sembrar un inóculo abundante si se utiliza la muestra directa. En caso contrario se debe hacer un pre-enriquecimiento y enriquecimiento de los especímenes antes de sembrar en este medio.
Como algunas cepas de Salmonella son inhibidas o crecen con dificultad, se aconseja acompañar este medio con otros agares selectivos para Salmonella.
Toda colonia con característica típica de Salmonella debe ser sometida a pruebas bioquímicas para su identificación definitiva.
Para probar el buen funcionamiento del medio agar verde brillante se pueden usar cepas ATCC para observar el desarrollo de las mismas sobre él.
Las cepas más frecuentes utilizadas para control de calidad son: Salmonella enteritidis ATCC 13076, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 25922, Shigella flexneri ATCC 12022, Staphylococcus aureus ATCC 6538.
Las 3 primeras deben dar colonias blancas rosáceas o trasparentes sobre fondo rojo. Salmonella con buen desarrollo y Proteus con crecimiento escaso o regular.
Para Klebsiella y Escherichia se esperan colonias amarillas verdosas con fondo amarillo y en el caso de Shigella y Staphylococcus deben ser inhibidas.
El medio deshidratado debe guardarse a temperatura ambiente, en lugar seco, debido a que el medio es muy higroscópico.
- Laboratorio Difco Francisco Soria Melguizo S.A. Brilliant Green Agar. 2009
- Laboratorio Britania. Verde Brillante Agar. 2015.
- Laboratorio BD. BD Brilliant Green Agar. 2013.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico Microbiológico. (5ta ed.). Argentina, Editorial Panamericana S.A.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana S.A