Tinción negativa: fundamento, técnica, ventajas y desventajas
La tinción negativa es un método de coloración especial para destacar la presencia de la cápsula en algunos microorganismos —principalmente Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae y Cryptococcus neoformans—, provenientes de muestras clínicas o de cultivos puros.
La muestra directa comúnmente utilizada para aplicar tinción negativa es el líquido cefalorraquídeo. Esta técnica representa una alternativa rápida para el diagnóstico presuntivo de meningitis, especialmente por Cryptococcus neoformans.
Así mismo, esta tinción puede ser aplicada sobre esputo y líquidos estériles en general, así como también sobre cepas obtenidas de cultivos puros jóvenes. Esta técnica utiliza nigrosina o tinta china para su ejecución; por tanto, es una metodología muy sencilla y económica de aplicar que brinda información de gran valor diagnóstico en poco tiempo.
En este sentido, cualquier laboratorio está en la capacidad de realizar esta coloración. Claro está, el laboratorio debe contar con un personal competente, capaz de reconocer las levaduras del Cryptococcus neoformans aislado o en gemación y diferenciarlas de leucocitos y artefactos que pueda presentar la muestra.
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La nigrosina y la tinta china actúan de manera similar; por ello se puede usar cualquiera de las dos sustancias indistintamente.
Esta técnica recibe el nombre de tinción negativa porque actúa de forma contraria al resto de las técnicas de coloración. En esta lo que queda sin teñir es la estructura que se está buscando o que se desea ver; es decir, los microorganismos.
Por lo tanto, la coloración se basa en teñir el fondo del frotis en un color oscuro. En este escenario las estructuras capsuladas resaltaran en color claro o incoloro.
Por lo general las levaduras se observan refringentes, rodeadas por un halo claro que corresponde a la cápsula. Esto ocurre porque la tinta china y la nigrosina son sustancias incapaces de penetrar el polisacárido que conforma la cápsula de los microorganismos vivos.
Vale destacar que tampoco penetran otras estructuras que pueden estar presentes en la muestra directa, como leucocitos o hematíes.
Ahora bien, si los microorganismos están muertos, la tintura puede penetrar dentro de los mismos, de tal manera que esta tinción también es útil para evaluar la viabilidad de los microorganismos.
Nigrosina
La nigrosina debe su nombre al color negro que posee. Es una sustancia sintética que se obtiene del calentamiento de la mezcla de compuestos orgánicos —tales como la nitrobencina, la anilina y el hidroclorito de anilina—, utilizando en dicha reacción un catalizador (hierro o cobre).
Tinta china
La tinta china es una sustancia utilizada principalmente por los asiáticos para la escritura, la elaboración de obras de arte y la pintura monocromática. Es muy popular en la cultura china.
Se obtiene de la tinta del calamar mezclada con carbón pulverizado, producto de la quema de árboles poco resinosos.
También es posible prepararla a partir del hollín de la incineración de hidrocarburos (aceites vegetales), junto con una gelatina proteica que le da la consistencia adecuada para evitar la precipitación de las partículas de carbón.
– No requiere ayuno.
– La muestra de LCR, esputo o líquido estéril debe contener al menos 1 ml de volumen y debe ser trasladada a temperatura ambiente al laboratorio de forma inmediata.
– Las muestras de LCR y líquidos estériles deben ser tomadas por un médico especializado.
– También puede ser un cultivo puro de una cepa sospechosa vinculada con los patógenos ya mencionados.
– Las muestras deben ser centrifugadas, luego se descarta el sobrenadante y se toma el sedimento.
– En una lámina portaobjeto limpia se coloca una gota del material centrifugado (sedimento) y una gota de tinta china o nigrosina.
– Debe mezclarse bien y cubrir con una lámina cubreobjeto, dejando que la gota se extienda como una película fina sin que rebase los bordes.
– Posteriormente se monta la preparación en el microscopio.
– Si la preparación queda muy oscura, se puede diluir con agua.
– Se toma una porción muy pequeña de un cultivo joven con una aguja de sembrado y se disuelve en una gota de tinta china colocada previamente sobre un portaobjeto limpio.
– Se coloca un cubreobjeto encima.
– Se observa en el microscopio a 10X y luego a 40X.
También puede disolverse una porción de la colonia en agua destilada, y de allí tomar una gota y mezclarla con la tinta china. De esta manera el preparado no quedará tan grueso, haciendo posible la observación de las estructuras en forma aislada; si hay aglomeraciones, no se observará bien.
Otra metodología es la siguiente:
– Colocar una gota del cultivo en suspensión en un extremo del portaobjeto.
– Colocar una gota de nigrosina en el mismo extremo y mezclar.
– Con ayuda de otro portaobjeto, extender la muestra como si se estuviese haciendo un frotis hematológico.
– Dejar secar y observar en el microscopio.
Primero se debe enfocar con objetivo de 10X para tener una visión amplia del campo. Posteriormente se debe buscar si hay espacios claros; si los hay, enfocar con 40X para ver los detalles.
– Es fácil de ejecutar.
– Es una técnica económica.
– Este método no requiere que el frotis sea fijado al calor ni con productos químicos; por lo tanto, los microorganismos son observados sin distorsiones.
– La preparación en fresco no necesita ser secada, por lo que se puede observar inmediatamente, generando resultados de forma rápida.
Una vez montadas, las preparaciones en fresco deben ser observadas inmediatamente; si se dejan secar ya no es posible observarlas y se deberá montar una nueva.
Otra función que puede cumplir la tinta china es en los laboratorios de patología. Esta se aplica en muestras de tejido extraídas quirúrgicamente con la finalidad de marcar los márgenes de resección del tumor.
El tejido marcado se rocía con ácido acético. Este actúa como un mordiente y evita que la tinta se salga cuando el tejido es sometido al procesamiento de rutina para el preparado de la biopsia.
El procedimiento consiste en bañar el tejido en alcohol y xileno, y luego embeber en cera de parafina. Este marcaje orienta al patólogo al momento de observar el tejido, indicándole dónde está el margen de resección quirúrgica u otro punto de interés.
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