Proteinasa K: características, actividad enzimática, aplicaciones
La proteinasa K es una enzima que pertenece al grupo de las proteasas de serina, es decir, posee en su centro catalítico activo un aminoácido serina y tiene la función de romper los enlaces peptídicos por hidrólisis. A su vez esta enzima pertenece a la familia de las proteínas subtilisinas (peptidasa S8).
La proteinasa K posee un peso molecular (PM) de 28.900 daltons y fue aislada por primera vez en 1.974 en extractos del hongo Engyodontium album, anteriormente conocido con el nombre de Tritirachium album Limber.
Presenta una alta capacidad proteolítica, demostrada al ser capaz de degradar la queratina presente en el cabello. La palabra queratina en inglés se escribe “keratin”, de allí proviene que haya sido denominada “proteinasa K”.
Por su alto poder de escindir proteínas nativas, esta enzima es útil en diversas técnicas de biología molecular. Principalmente se usa para aislar y preparar ácidos nucleicos con peso molecular (PM) alto.
La proteinasa K actúa liberando al ADN nuclear, mientras destruye a las proteínas e inactiva a las RNasas y las DNasas, es decir, elimina a las nucleasas en las preparaciones de ADN y ARN.
Por otra parte, se ha visto que la proteinasa K puede hidrolizar algunas proteínas nativas desnaturalizadas, lo que ha hecho despertar el interés de los investigadores para su utilización en el estudio de las proteínas priónicas (PrPC).
Sin embargo, a pesar de su alta potencia proteolítica existen proteínas que son resistentes a la acción de la proteinasa K. Entre ellas, se encuentran algunas proteínas anómalas denominadas priones (PrPSc), asociadas con encefalopatías espongiformes transmisibles.
Índice del artículo
- 1 Características de la proteinasa K
- 2 Actividad enzimática
- 3 Aplicaciones
- 4 Ventajas de la proteinasa K
- 5 Proteínas resistentes a la proteinasa K
- 6 Referencias
La proteinasa K posee una estructura terciaria conformada por tres capas, con una lámina β de siete cadenas inmiscuidas entre dos capas de hélices. Por pertenecer a la familia de las peptidasas S8 se caracteriza por presentar en su sitio activo una tríada catalítica, cuyo orden secuencial es (Asp, His y Ser), lo cual las diferencia de otras familias de peptidasas.
Esta enzima del grupo de las proteasas de serina, se caracteriza por hidrolizar los enlaces peptídicos cercanos al grupo carboxílico de los aminoácidos alifáticos y aromáticos.
Por otra parte, es capaz de actuar en presencia de ciertas sustancias corrosivas, tales como dodecilsulfato sódico (SDS), Tris-HCL y EDTA, los cuales se usan para ayudar a la desnaturalización de las proteínas, haciendo que pierdan su estructura nativa.
Este es un paso previo en la preparación de proteínas para la técnica de electroforesis. El rango de pH al cual actúa la proteinasa K es bastante amplio (2.0 a 12.0), con un pH óptimo entre 7.5 a 12.0, y su punto isoeléctrico es de 8.9. Como puede observarse es activa frente a un rango muy amplio de pH.
Otra característica que resalta en la proteinasa K es su estabilidad en presencia de altas temperaturas (50 – 60°C).
La proteinasa K necesita la presencia del ión calcio, si bien este no afecta su actividad, si es indispensable para mantener su estabilidad.
Para que la proteinasa K realice la digestión completa del sustrato es necesario un tiempo de contacto aproximado entre 5 minutos hasta 2 horas.
Sin embargo, en este sentido Daza y colaboradores compararon la pureza del ADN obtenido a varios tiempos de exposición frente a la proteinasa K, y llegaron a la conclusión de que una incubación prolongada (hasta 24 h) mejora significativamente la calidad del ADN.
Ahora bien, en relación a la concentración que se utiliza de la enzima proteinasa K en los diferentes protocolos, se puede decir que es muy variada.
Puede utilizarse desde concentraciones muy bajas (5 µg/ml) hasta concentraciones de 500 µg/ml. Pero las concentraciones de trabajo más frecuentes oscilan entre 50–100μg /ml, especialmente para la digestión de proteínas e inactivación de nucleasas. Aunque para el tratamiento de tejidos se requiere una concentración de 2 mg/ml.
Sus aplicaciones son muy amplias y se pueden resumir en las siguientes:
-Se utiliza en la digestión de proteínas y extracción de ADN por varios métodos como son: salting-out, PK-SDS, bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB), acetato de potasio modificado y extracción con yoduro de sodio.
-Inactivación de nucleasas (RNasas y las DNasas).
-En la técnica de hibridación in situ (HIS), para ayudar a la liberación del ácido nucleico, además de eliminar proteínas indeseables.
-Modificación de proteínas.
-A nivel de investigación, en estudios diversos.
Se han realizado diversos estudios comparativos entre técnicas de extracción de ADN que usan Proteinasa K, con otros que no la utilizan y todos concluyen que hay mayores beneficios cuando se usa la enzima. Entre las ventajas se pueden mencionar las siguientes:
-Se obtiene ADN de alto peso molecular, de alta calidad y pureza.
-El ADN extraído es estable hasta por 3 meses.
El ADN extraído puede ser utilizado en las siguientes técnicas: Southern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), electroforesis, entre otras.
Diversas investigaciones han concluido que los priones (proteínas anómalas PrPSc tóxica) se diferencian de las proteínas PrPC (nativas) por ser resistente a la acción de la proteinasa K, mientras que las PrPC son sensibles a su acción.
Otros autores han descrito que en la estructura de las PrPSc existen porciones sensibles y otras resistentes a la proteinasa K. Sin embargo, ambas partes son igual de tóxicas e infectantes.
Por otra parte, Bastian y colaboradores en 1987 aislaron 4 proteínas de 28, 30, 66 y 76 kda provenientes de una especie de Spiroplasma mirum. Todas resultaron ser resistentes a la acción de la proteinasa K y además tuvieron reacción cruzada con algunos priones.
Se sabe que esta especie puede causar cataratas y daños neurológicos importantes y debido a los hallazgos científicos de Bastian, entre otras investigaciones, se ha tratado de relacionar a este microorganismo con las encefalopatías espongiformes transmisibles.
Sin embargo, la etiología de esta patología neurológica degenerativa sigue siendo atribuida en la actualidad a los priones.
En este sentido, Butler y colaboradores en 1991 identificaron y caracterizaron una clase de proteína resistente a la proteinasa K de 40 kda proveniente de dos cepas de Mycoplasma hyorhinis. Este patógeno afecta a los cerdos, infectando sus tejidos, pero en este caso no hubo reacción cruzada con los priones probados.
Se requieren más investigaciones para dilucidar muchas incógnitas al respecto.
- Bastian F, Jennings R, and Gardner W. 1987. Antiserum to scrapie-associated fibril protein cross-reacts with Spiroplasma mirum fibril proteins. J. Clin. Microbiol. 25:2430-2431.
- Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Evaluación de un método de extracción y purificación de DNA a partir de tejido muscular fijado en formaldehido de cadáveres no identificados. Revista Med, 2014; 22 (1): 42-49,
- Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, And Mcgarrity G. Identification and Characterization of Proteinase K-Resistant Proteins in Members of the Class Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59(3):1037-1042
- López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Comparación de dos protocolos de extracción de ADN de Trypanosoma cruzi cultivados en medio axénico. Rev. Perú. Med. Exp. Salud Pública 2014; 31 (2): 222-227. Disponible en: scielo.org
- Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E y Palma W. Determinación de la efectividad de cinco protocolos de extracción de ADN a partir de material parafinado para estudios moleculares. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1):10-19.