Prueba de la coagulasa: fundamento, procedimiento y usos
La prueba de la coagulasa es una técnica de laboratorio que se utiliza para poner en evidencia la presencia de la enzima coagulasa. Esta enzima tiene la propiedad de coagular el plasma. Loeb en 1903 fue el primero en describir a esta enzima.
Esta prueba se realiza a los cocos Gram positivos, catalasa positivos, permitiendo distinguir las cepas de Staphylococcus aureus del resto de los estafilococos, ya que él es el único microorganismo de importancia clínica que la produce.
En este sentido, los miembros de la Familia Staphylococaceae que dan esta prueba negativa son a menudo denominados Staphylococcus coagulasa negativos.
Existen algunas cepas diferentes a S. aureus que pueden producir coagulasa, como por ejemplo Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius y S. delphini.
Sin embargo, las tres primeras son de importancia clínica a nivel veterinario y muy rara vez podrían encontrarse como agente causal de infecciones en el humano, mientras que S. delphini se le encuentra únicamente en ambientes marinos.
Además, se diferencian fácilmente porque S. hyicus y S. intermedius no fermentan el manitol y S. schleiferi spp coagulans no fermenta la maltosa, ni la trehalosa, mientras que S. aureus sí fermenta estos carbohidratos.
La presencia de la enzima coagulasa ha sido vinculada a la virulencia de las cepas. Sin embargo, esta teoría se ha ido cayendo, en vista de que se observan otras especies coagulasa negativas virulentas capaces de producir infecciones importantes.
Índice del artículo
Staphylococcus aureus produce dos tipos de coagulasa, una que permanece unida a la pared celular, también llamada factor de aglutinación o factor reactivo de la coagulasa (FRC), y una extracelular que se libera en cultivos líquidos. Es por ello que reciben el nombre de coagulasa unida y coagulasa libre respectivamente.
La enzima coagulasa debe su nombre a la acción que produce. Esta tiene la capacidad de transformar el fibrinógeno en fibrina, creando un coágulo evidente cuando se halla en el plasma, es decir, esta enzima simula la actividad de la trombina de la cascada de la coagulación.
De hecho, una de las teorías más aceptadas es que la coagulasa unida reacciona con la coagulasa libre para activar a los factores de la coagulación. Esta activación genera una sustancia que actúa de forma similar a como lo hace la protrombina, creando un compuesto con la función de la trombina.
La diferencia con la cascada de la coagulación normal radica en que esta reacción no necesita la presencia de calcio y no es afectada por la heparina.
Para realizar la prueba de la coagulasa basta con enfrentar un cultivo fresco de Staphylococcus con un plasma preferiblemente de conejo y así observar la formación o no del coágulo.
Existen técnicas específicas para detectar la coagulasa unida y la coagulasa unida y libre a la vez.
Algunas cepas de S. aureus dan un resultado positivo más rápidas que otras. La velocidad de la formación del coágulo es directamente proporcional a la concentración de coagulasa presente.
La técnica de la prueba de la coagulasa en portaobjeto detecta la coagulasa unida y la técnica que se realiza en tubo detecta tanto la coagulasa unida como la libre.
Materiales
-Lámina portaobjeto limpio
-Plasma de conejo preferiblemente, también puede usarse plasma humano o de caballo. El plasma puede adquirirse comercialmente liofilizado y reconstituirse cuando se va a usar o puede utilizarse fresco (recién tomado). Otra alternativa viable es el uso de fibrinógeno.
-Solución salina (0,85%) estéril (SSF).
Obtención del plasma fresco
Extraer sangre venosa humana o de animal. Se puede usar cualquiera de los siguientes anticoagulantes: EDTA, oxalato de calcio, heparina o citrato de sodio. Mezclar bien y centrifugar. Retirar asépticamente el sobrenadante (plasma), sin hematíes y depositar en un tubo estéril.
Plasma liofilizado
Reconstituir como lo especifique el vial del kit comercial.
Fibrinógeno fresco
A partir de un plasma citratado, mezcle a partes iguales el plasma con una solución saturada de cloruro de sodio. Dejar precipitar y centrifugar.
Descartar sobrenadante, reconstituir el precipitado hasta 5 veces su volumen con agua destilada estéril. Agregar 5 unidades de heparina por cada ml de fibrinógeno. Guardar en un tubo estéril.
Técnica
En un portaobjeto se coloca una gota de solución salina y una gota de plasma de forma separada. Tome con el asa de platino 1 o 2 colonias puras del microorganismo a probar.
Mezcle la carga bacteriana en la gota de plasma y repita la operación en la gota de SSF. Observe los resultados de forma inmediata. Un resultado positivo será aquel en donde se observe la formación de un aglutinado macroscópico (precipitado blanco) al cabo de un minuto del lado de la gota con plasma.
La gota de SSF sirve de control negativo. Si se observa aglutinación con la SSF, esto quiere decir que el microorganismo se auto-aglutina, pudiendo proporcionar resultados falsos positivos. En este caso se debe corroborar con la prueba en tubo.
Se recomienda también montar un control positivo con una cepa conocida de S. aureus.
Interpretación
Aglutinación dentro de los 5 a 20 seg (prueba positiva fuerte).
Aglutinación variable ocurrida entre 20 segundos y un minuto (prueba positiva retardada).
Cierto grado de aglutinación después de un minuto (prueba dudosa). Se recomienda repetir la prueba o confirmar por el método en tubo.
No hay aglutinación (prueba negativa).
Resultado con SSF. Debe dar siempre negativa, si da positiva automáticamente el resultado de la prueba queda invalidado.
Materiales
-Tubo de ensayo estéril
-Plasma
-Baño de María a 37°C.
Técnica
Mida con una pipeta estéril 0,5 ml de plasma y colóquelo en un tubo de ensayo 12 x 75. Cargue el asa de platino con 2 a 4 colonias puras a estudiar provenientes de un cultivo sólido de 18 a 24 horas y disuélvala en el plasma cuidadosamente, mezcle e incube a 37°C por 4 horas.
Examinar el tubo a la primera hora sin agitarlo, solo incline suavemente. Si aún no se observa coágulo, se puede seguir observando cada 30 minutos hasta completar las 4 horas. Si después de 4 horas aún sigue negativo se puede dejar hasta por 24 horas pero a temperatura ambiente. Observar y reportar el resultado.
En base a la experiencia, algunos microbiólogos recomiendan usar 500 µl de una suspensión bacteriana proveniente de un cultivo de 18 horas en medio líquido para realizar la prueba.
Al parecer ofrece resultados más rápidos y confiables que cuando se emulsionan colonias provenientes de medios sólidos, especialmente si se ha usado plasma humano obtenido del banco de sangre.
El uso de cepas provenientes de un caldo ayuda a diluir la posible presencia de anticuerpos anti-estafilocócicos humanos en el plasma que puedan inhibir la acción de la coagulasa.
Interpretación
Si se observa un coágulo que abarca todo el líquido (coagulación completa) o coágulo que nada en el líquido restante (coagulación parcial) debe considerarse como una prueba positiva.
Si no se forma coágulo, es decir, la suspensión queda homogénea, la prueba es negativa.
El fibrinógeno se utiliza igual que el plasma y sirve tanto para la prueba en portaobjeto como para la prueba en tubo. Proceder como fue descrito para plasma e interpretar de igual forma.
Se utiliza para diferenciar el Staphylococcus aureus de los estafilococos coagulasa negativos.
Disponer de cultivos frescos de una cepa de S. aureus para ser usado como control positivo. También se puede disponer de una cepa de S. epidermidis como control negativo.
-Una prueba positiva no debe dejarse en incubación por 24 horas, pues el S. aureus produce una fibrinolisina que disuelve el coágulo.
-Para una prueba confiable debe utilizarse plasma fresco o recién reconstituido, así como también es importante usar cultivos bacterianos frescos (18 a 24 h). Esto evita falsos negativos.
-La prueba debe realizarse conjuntamente con un control negativo y uno positivo.
-Algunos medios sólidos pueden interferir en la prueba de la coagulasa. No se recomienda usar colonias provenientes de agar manitol salado.
-Si se usa plasma citratado se recomienda colocar 5 unidades de heparina por ml de plasma para evitar falsos positivos. Esto se debe a que algunos microorganismos diferentes a S. aureus pueden descomponer el citrato y hacer que el plasma se coagule. En este caso es recomendable hacer Gram y una prueba de catalasa.
-Es importante, en la prueba del tubo, monitorear la reacción cada 30 minutos, pues hay cepas de S. aureus que producen altas concentraciones de fibrinolisina y diluirán el coágulo recién formado rápidamente. Evita falsos negativos.
-Al monitorear la prueba se debe evitar agitar el tubo de forma brusca, esto puede destruir el inicio de la formación del coágulo que luego no se restablecerá, ocasionando falsos negativos.
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- “Coagulasa.” Wikipedia, La enciclopedia libre. 12 feb 2019, 04:23 UTC. 22 abr 2019, 15:50 wikipedia.org.