Endonucleasas: funciones, tipos y ejemplos
Las endonucleasas son enzimas que cortan los enlaces fosfodiéster localizados en el interior de la cadena de nucleótidos. Los sitios de restricción de las endonucleasas son muy variados. Algunas de estas enzimas cortan al ADN (el ácido desoxirribonucleico, nuestro material genético) casi en cualquier sitio, es decir son inespecíficas.
En contraste, existe otro grupo de endonucleasas que son muy específicas en la región o secuencia que van a escindir. Este grupo de enzimas se conoce como enzimas de restricción, y son muy útiles en la biología molecular. En este grupo tenemos a las conocidas enzimas Bam HI, Eco RI y Alu I.
Contrario a las endonucleasas, existen otro tipo de proteínas catalíticas – las exonucleasas – que se encargan de romper los enlace fosfodiéster en el extremo de la cadena.
Índice del artículo
- 1 Endonucleasas de restricción
- 2 Funciones y aplicaciones de las endonuclesas de restricción
- 3 Tipos de endonucleasas de restricción
- 4 Ejemplos
- 5 Referencias
Las endonucleasas de restricción o enzimas de restricción son proteínas catalíticas que se encargan de escindir los enlaces fosfodiéster en el interior de la cadena de ADN en secuencias muy concretas.
Estas enzimas pueden ser adquiridas en múltiples empresas de biotecnología y su uso es casi indispensable dentro de las técnicas actuales de manipulación del ADN.
Las endonucleasas de restricción se nombran usando las primeras letras del nombre científico binomial del organismo del que provienen, seguido de la cepa (este es opcional) y finaliza con el grupo de enzimas de restricción al que pertenecen. Por ejemplo, Bam HI y Eco RI son endonucleasas muy usadas.
La región de ADN que la enzima reconoce se denomina sitio de restricción y es propio de cada endonucleasa, aunque varias enzimas pueden coincidir en los sitios de restricción. Este sitio consiste, generalmente, en una secuencia palindrómica corta de unas 4 a 6 pares de bases de longitud, como AGCT (para Alu I) y GAATTC para Eco RI.
Las secuencias palindrómicas son secuencias que, aunque se lean en dirección 5´ a 3´ o 3´ a 5´, son idénticas. Por ejemplo, para el caso de Eco RI, la secuencia palindrómica es: GAATTC y CTTAAG.
Afortunadamente para los biólogos moleculares, las bacterias han desarrollado en el curso de la evolución una serie de endonucleasas de restricción que fragmentan internamente el material genético.
En la naturaleza, estas enzimas han evolucionado – presumiblemente – como un sistema de protección bacteriana frente a la invasión de moléculas de ADN foráneo, como las provenientes de los fagos.
Para poder discriminar entre el material genético propio y foráneo, estas endonucleasas de restricción pueden reconocer secuencias específicas de nucleótidos. Así, el ADN que no posea dicha secuencia puede estar sin perturbaciones en el interior de la bacteria.
En contraste, cuando la endonucleasa reconoce el sitio de restricción, se une al ADN y lo corta.
Los biólogos están interesados en estudiar el material genético de los seres vivos. Sin embargo, el ADN está formado de varios millones de pares de bases de longitud. Estas moléculas son extremamente largas y deben ser analizadas en pequeños fragmentos.
Para cumplir con este objetivo, las endonucleasas de restricción son integradas en los diversos protocolos de biología molecular. Por ejemplo, un gen individual puede ser capturado y replicado para futuros análisis. Este proceso es llamado “clonar” un gen.
Los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción hacen referencia al patrón de secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que las endonucleasas de restricción son capaces de reconocer y cortar.
Gracias a la especificidad de las enzimas, cada organismo se caracteriza por un patrón específico de corte en el ADN, originando fragmento de longitudes variables.
Históricamente, las endonucleasas de restricción se han clasificado en tres tipos de enzimas, designadas con números romanos. Últimamente, se ha descrito un cuarto tipo de endonucleasa.
La característica más importante de las endonucleasas del tipo I es que son proteínas formadas por varias subunidades. Cada una de estas funciona como un solo complejo proteico y usualmente poseen dos subunidades denominadas R, dos M y una S.
La porción S es la encargada del reconocimiento del sitio de restricción en el ADN. La subunidad R, por su parte, es esencial para el clivaje y la M se encarga de catalizar la reacción de metilación.
Existen cuatro subcategorías de las enzimas del tipo I, conocidas por las letras A, B, C y D, que son de uso común. Esta clasificación está basada en la complementación genética.
Las enzimas de tipo I fueron las primeras endonucleasas de restricción en ser descubiertas y purificadas. Sin embargo, las más útiles en biología molecular son las del tipo II que serán descritas en la próxima sección.
Las endonucleasas de restricción del tipo II reconocen secuencias específicas de ADN y realizan el clivaje en una posición constante cerca de una secuencia que produzca fosfatos 5´ e hidroxilos 3´. Generalmente requieren como cofactores iones magnesio (Mg2+), pero existen algunas que tienen requerimientos muchos más específicos.
Estructuralmente, pueden aparecer como monómeros, dímeros o hasta tetrámeros. La tecnología recombinante usa a las endonucleasas de tipo II y por esta razón se han caracterizado más de 3500 enzimas.
Estos sistemas enzimáticos están compuestos por dos genes, denominados mod y res, que codifican para las subunidades que reconocen el ADN y para modificaciones o restricciones. Ambas subuniudades son necesarias para la restricción, proceso totalmente dependiente de la hidrólisis del ATP.
Para poder escindir la molécula de ADN, la enzima debe interactuar con dos copias de la secuencia de reconocimiento no palindrómica y los sitios deben estar en una orientación inversa en el sustrato. El clivaje es precedido por una translocación del ADN.
Un grupo adicional ha sido identificado últimamente. El sistema está compuesto de dos o más genes que codifican para proteínas que escinden solamente secuencias de ADN modificadas, ya sea metilado, hidroximetilado o glucosil hidrometilado.
Por ejemplo, la enzima EckKMcrBC reconoce dos dinucleótidos de la forma general RmC; una purina seguida de una citosina metilada, las cuales pueden estar separadas por varias pares de bases – desde 40 hasta casi 3000. La escisión tiene lugar unos 30 pares de base tras el sitio que la enzima reconoce.
Las endonucleasas de este tipo son también conocidas como endonucleasas “homing”. Estas enzimas reconocen y cortan la secuencia diana de ADN en sitios únicos del genoma de 14 a 40 pb.
A menudos estas enzimas están codificadas en intrones y se cree que su función es promover la transferencia horizontal de las secuencias cortadas. Luego del corte se produce una reparación de ruptura en la doble hélice de ADN basada en la secuencia complementaria.
La endonucleasa I de E. coli actúa como sistema de defensa contra fagos y parásitos. Está se localiza principalmente entre la membrana citoplasmática y la pared celular. Produce roturas bicatenarias en el ADN foráneo con el que interactúa en el espacio periplásmico.
Las endonucleasas de tipo CRISPR-Cas son enzimas que actúan en el mecanismo de defensa de muchos tipos de bacterias. Estas identifican y cortan secuencias específicas de ADN de organismos invasores, que generalmente son virus.
Recientemente, investigadores del Instituto de Tecnología de Massachusetts (MIT) descubrieron el sistema de edición genómica CRISPR-Cas12bm con una alta precisión para la modificación de células humanas.
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