Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC): fundamento, equipo, tipos
La cromatografía líquida de alta eficacia es una técnica instrumental utilizada en análisis químicos con la cual se permite separar mezclas, purificar y cuantificar sus componentes, así como realizar otros estudios. Se le conoce con la abreviatura HPLC, derivada del inglés: High Performance Liquid Chromatography.
Así pues, como su mismo nombre señala, funciona manipulando líquidos. Estos consisten en una mezcla compuesta por el analito o la muestra de interés, y uno o más solventes que actúan como la fase móvil; es decir, la que arrastra al analito por todo el equipo del HPLC y la columna.
La HPLC se halla ampliamente difundida por los laboratorios de análisis de calidad en numerosas empresas; tales como las farmacéuticas y la alimenticia. El analista en cuestión debe preparar la muestra, la fase móvil, comprobar la temperatura y otros parámetros, y colocar los viales dentro de la rueda o carrusel para que el equipo realice las inyecciones automáticamente.
Los equipos de HPLC vienen acoplados a una computadora mediante la cual puede observarse los cromatogramas generados, así como iniciar los análisis, controlar el caudal de la fase móvil, programar el tipo de elución (isocrática o por gradiente), y encender los detectores (Uv-Vis o el espectrofotómetro de masas).
Índice del artículo
A diferencia de la cromatografía líquida convencional, como la del papel o la de la columna rellena con sílice gel, la HPLC no depende de la gravedad para que el líquido moje la fase estacionaria. En su lugar, trabaja con bombas de altas presiones, las cuales irrigan la fase móvil o eluyente por la columna con mayor intensidad.
De esta manera, no es necesario verter la fase móvil a cada rato por la columna, sino que el sistema lo hace continuamente y con caudales más altos.
Pero la eficiencia de esta técnica no se debe exclusivamente a este detalle, sino también a las diminutas partículas de relleno que conforman la fase estacionaria. Al ser más pequeñas, su área de contacto con la fase móvil es mayor, por lo que interaccionará en mejor grado con el analito y se separarán más sus moléculas.
Estas dos características, más el hecho de que la técnica permite el acoplamiento de detectores, hacen del HPLC muy superior a la cromatografía de capa fina o de papel. Las separaciones son más eficientes, la fase móvil se desplaza mejor a través de la fase estacionaria, y los cromatogramas permiten detectar alguna falla en el análisis.
Arriba se muestra un diagrama simplificado de cómo funciona un equipo de HPLC. Los solventes se encuentran en sus respectivos recipientes, dispuestos con mangueras para que la bomba lleve un pequeño volumen de los mismos hacia el interior del equipo; tenemos así la fase móvil.
La fase móvil o eluyente debe desgasificarse primero, de tal modo que las burbujas no afecten la separación de las moléculas de analito, el cual se mezcla con la fase móvil una vez el equipo haya realizado las inyecciones.
La columna cromatográfica se ubica dentro un horno que permite regularizar la temperatura. Así, para distintas muestras se tienen temperaturas adecuadas para conseguir separaciones de alto rendimiento, así como también se tiene un amplio catálogo de columnas y tipo de rellenos o fases estacionarias para análisis en específicos.
La fase móvil con el analito disuelto ingresa a la columna, y de ella eluyen primero las moléculas que “sienten” menos afinidad por la fase estacionaria, mientras que eluyen después las que son más retenidas por ella. Cada molécula eluida genera una señal visualizada en el cromatograma, donde se observan los tiempos de retención de las moléculas separadas.
Y por otro lado, la fase móvil después de pasar por el detector termina en un recipiente de desecho.
Existen muchos tipos de HPLC, pero entre todos ellos los más resaltantes son los cuatro siguientes.
La cromatografía de fase normal se refiere a aquella donde la fase estacionaria es de naturaleza polar, mientras que la móvil apolar. Aunque se le llame normal, de hecho es la menos utilizada, siendo la de la fase inversa la más difundida y eficiente.
Al tratarse de una fase inversa, ahora la fase estacionaria es apolar y la fase móvil polar. Esto es especialmente útil en análisis bioquímicos, pues muchas biomoléculas se disuelven mejor en agua y en solventes polares.
En este tipo de cromatografía el analito, con carga positiva o negativa, se desplaza a través de la columna sustituyendo los iones que alberga. Mientras mayor sea la carga, mayor será su retención, por lo que es ampliamente utilizada para separar complejos iónicos de metales de transición.
Esta cromatografía, más que separar, se encarga de purificar la mezcla resultante. Como su nombre indica, el analito se separa ya no en función de qué tan afín sea a la fase estacionaria, sino de acuerdo a su tamaño y masas moleculares.
Las moléculas más pequeñas serán más retenidas que las moléculas grandes, pues estas últimas no quedan atrapadas entre los poros de los rellenos poliméricos de las columnas.
La HPLC permite realizar tanto análisis cualitativos como cuantitativos. En lo que respecta a lo cualitativo, al comparar los tiempos de retención del cromatograma bajo determinadas condiciones, se puede detectar la presencia de un compuesto en particular. Dicha presencia puede ser indicativa de una enfermedad, adulteración, o consumo de drogas.
Por lo tanto, es un equipo forma parte de los laboratorios de diagnóstico. Asimismo, se halla dentro de las industrias farmacéuticas, pues permite comprobar la pureza del producto, así como la calidad del mismo en lo que respecta a su disolución en el medio gástrico. Los materiales de partida también se someten al HPLC para purificarlos y garantizar un mejor rendimiento en la síntesis de fármacos.
La HPLC permite analizar y separar mezclas complejas de proteínas, aminoácidos, carbohidratos, lípidos, porfirinas, terpenoides, y en esencia es una excelente opción para trabajar con extractos vegetales.
Y para finalizar, la cromatografía por exclusión molecular permite seleccionar polímeros de diferentes tamaños, ya que algunos pueden ser más pequeños o grandes que otros. De esta manera se obtienen productos con bajas o altas masas moleculares promedio, siendo esto un factor determinante en sus propiedades y futuras aplicaciones o síntesis.
- Day, R., & Underwood, A. (1989). Química Analítica Cuantitativa. (quinta ed.). PEARSON Prentice Hall.
- Bussi Juan. (2007). Cromatografía de líquidos de alta eficacia. [PDF]. Recuperado de: fing.edu.uy
- Wikipedia. (2019). High-performance liquid chromatography. Recuperado de: en.wikipedia.org
- Clark Jim. (2007). High Performance Liquid Chromatography. Recuperado de: chemguide.co.uk
- Matthew Barkovich. (05 de diciembre de 2019). High Performance Liquid Chromatography. Chemistry LibreTexts. Recuperado de: chem.libretexts.org
- G.P. Thomas. (15 de abril de 2013). High Performance Liquid Chromatography (HPLC) – Methods, Benefits and Applications. Recuperado de: azom.com