Agar cuenta estándar: fundamento, preparación y usos
El agar cuenta estándar es un medio de cultivo sólido, no selectivo, diseñado para la cuantificación de la carga microbiana aerobia presente en muestras de aguas de consumo, aguas residuales, bebidas lácteas, entre otros alimentos. A este medio también se le conoce como agar PCA, por sus siglas en inglés Plate Count Agar. Fue creado en 1953 por Buchbinder, Baris y Goldstein.
El medio agar cuenta estándar está compuesto por extracto de levadura, tripteína, glucosa, agar y agua destilada. Esta formulación contiene elementos básicos nutricionales que permite el desarrollo de la carga microbiana aerobia presente, no exigente.
Como el medio no contiene inhibidores, las bacterias pueden desarrollarse sin ningún tipo de restricciones, por ello es ideal para el recuento general de colonias. Sin embargo, la técnica de cuantificación en placa no detectará todas las bacterias presentes, sino solo aquellas que sean capaces de crecer bajo las condiciones ambientales a la que sea sometido el agar cuenta estándar sembrado.
En este sentido, la técnica de cuantificación en placa busca determinar por lo general la cantidad de bacterias del tipo mesófilas aerobias, es decir, aquellas que se desarrollan en temperaturas entre 25 y 40°C, con una temperatura óptima de crecimiento a 37°C.
Este grupo bacteriano es muy importante, porque allí se encuentran la mayoría de las bacterias patógenas para el hombre.
Cabe destacar que en ocasiones puede interesar cuantificar la cantidad de bacterias psicrófilas presentes en los alimentos. Estas bacterias son aquellas que se desarrollan a bajas temperaturas ( 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.
Así mismo, las bacterias termófilas, que se desarrollan en un rango entre 50°C a 80°C o más, pueden ser importantes en ciertos tipos de alimentos como los enlatados.
La cuantificación microbiana se expresa en unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o mililitro de muestra.
Índice del artículo
El medio cuenta estándar está diseñado para permitir el desarrollo satisfactorio de las bacterias aerobias no exigentes, ya que el extracto de levadura, la tripteína y la glucosa proporcionan los nutrientes necesarios para el buen desarrollo microbiano.
Por otra parte, el medio posee un color claro y un aspecto transparente, por ello es ideal para la visualización de las colonias desarrolladas por el método de sembrado en profundidad (vertido en placa).
También es posible el contaje de colonias por el método de sembrado en superficie con espátula de Drigalski.
Cuando la carga microbiana es alta, se deben hacer diluciones decimales de la muestra en estudio para poder realizar el contaje de las UFC.
Cabe destacar que este medio es recomendado por la American Public Health Association (APHA) para el recuento de mesófilos aerobios.
Pesar 23,5 gr del medio deshidratado y disolver en un litro de agua destilada. Para disolver completamente se debe calentar la mezcla agitando frecuentemente hasta que hierva. Los pasos sub-siguientes dependen de la técnica de sembrado que se vaya a utilizar.
Distribuir dispensando de 12 a 15 ml en tubos de ensayo. Posteriormente, esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos. Dejar solidificar verticalmente en forma de taco. Guardar en nevera hasta su uso.
Fundir el taco cuando se vaya a utilizar. Una vez fundido mantenerlo en baño de María a 44-47°C mientras se preparan las muestras.
Esterilizar el medio en autoclave a 121 °C y posteriormente distribuir 20 ml en placas de Petri estériles. Dejar solidificar, invertir y guardar en nevera hasta su uso.
Atemperar las placas antes de usar. El pH del medio debe quedar en 7,0 ± 0,2.
El agar cuenta estándar se usa en la técnica de recuento de mesófilos aerobios durante el análisis microbiológico de agua y alimentos. El contaje de los mesófilos aerobios es necesario, ya que determina la calidad sanitaria de la muestra en estudio.
La aplicación de esta técnica (utilizando este medio) permite la visualización macroscópica de colonias aisladas para su cuantificación.
-Procedimiento
La técnica consiste en lo siguiente:
1) Homogeneizar la muestra con el fin de redistribuir las bacterias presentes.
2) Se realiza una suspensión inicial en un frasco o bolsa estéril, respetando la relación 10 gr o 10 ml de muestra en 90 ml de diluyente (10-1).
3) A partir de la suspensión inicial se realizan las diluciones decimales pertinentes dependiendo el tipo de muestra. Ej: (10-2, 10-3, 10-4). Las diluciones se realizan con agua peptonada o solución amortiguadora de fosfatos.
Para ello se toma 1 ml de la suspensión inicial y se coloca en 9 ml de diluyente, continuar las diluciones si es necesario tomando ahora 1 ml de la dilución 10-2 y así sucesivamente.
4) Se toma 1 ml de cada dilución y se colocan en placas de Petri estériles vacías.
5) Agregar a cada placa 12 a 15 ml de agar cuenta estándar previamente fundido y reposado a 44 – 47°C.
6) Dar movimientos rotatorios suaves a las placas para distribuir la muestra junto al agar uniformemente y dejar solidificar.
7) Invertir las placas e incubar a 37°C en aerobiosis por 24 a 48 horas.
8) Culminado el tiempo se procede a examinar las placas y a contar las colonias en la dilución que así lo permita. Se elige para el contaje aquellas placas que tengan entre 30 a 300 UFC.
El contaje se puede hacer manual o se puede hacer uso del equipo contador de colonia.
Los valores permitidos por ml de muestra pueden variar de un país a otro según las normas por las cuales se rijan.
-Cálculo de las UFC
El cálculo general se realiza utilizando la siguiente fórmula:
Expresar los resultados en 1 o 2 dígitos, multiplicando por la base 10 adecuada. Ejemplo: si el resultado es 16.545 se redondea en base al tercer dígito a 17.000 y se expresará de la siguiente manera: 1,7 x 104. Ahora bien, si el resultado fuese 16.436 se redondea a 16.000 y se expresa 1.6 x 104.
-Procedimiento
-Inocular con 0,1 ml de la muestra directa si es líquida, suspensión inicial 10-1 o de las diluciones consecutivas 10-2, 10-3 etc, en el centro de una placa de agar cuenta estándar.
-Distribuir uniformemente la muestra con espátula de Drigalski o varilla de vidrio en forma de L. Dejar reposar por 10 minutos.
-Invertir las placas e incubar en aerobiosis a 37°C por 24 a 48 horas.
-Proceder a contar las colonias, elegir aquellas placas que se encuentren en un rango entre 20 – 250 UFC.
-Cálculo de las UFC
Para el cálculo se aplica el factor de dilución, que es el inverso. Se redondea el número a 2 dígitos significativos (redondeando según el tercer dígito) y se expresa en potencia de base 10. Por ejemplo, si se cuentan 224 UFC en la muestra sin dilución (10-1), se reporta 22 x 101 UFC, pero si la cifra fuese 225 se reporta 23 x 101 UFC.
Ahora bien, si se cuentan 199 UFC en la dilución 10-3, se reportará 20 x 104 UFC, pero si se cuentan 153 UFC en la misma dilución se reportará 15 x 104 UFC.
El medio de cultivo cuenta estándar puede ser evaluado utilizando cepas conocidas certificadas, tales como: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.
Si el medio de cultivo está en óptimas condiciones se espera un crecimiento satisfactorio en todos los casos, a excepción de L. fermentum que puede tener un rendimiento regular.
Para evaluar la esterilidad del medio de cultivo se deben incubar una o dos placas de cada lote preparado (sin inocular) a 37°C en aerobiosis por 24 horas. Al cabo de este tiempo no debe observarse ningún tipo de crecimiento, ni cambio de color del medio.
-No fundir el agar más de una vez.
-El medio preparado puede durar hasta 3 meses siempre y cuando se mantenga en nevera y protegido de la luz.
-Este medio no es adecuado para microorganismos exigentes, ni anaerobios.
- Administración Nacional de Medicamentos Alimentos y Tecnología médica (ANMAT). Análisis microbiológico de los alimentos, metodología analítica oficial, microorganismos indicadores. 2014 Volumen 3. Disponible en: anmat.gov.ar
- Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, S.A. Plate Count Agar. 2009. Disponible en: http://f-soria.es
- Laboratorios Conda Pronadisa. Agar para métodos estándar (PCA) según APHA y ISO 4833. Disponible en: condalab.com
- Laboratorios Britania. Recuento en placa agar. 2015. Disponible en: britanialab.com
- Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B y Velázquez O. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México. Disponible en: depa.fquim.unam