Medio OF: fundamento, preparación, usos y limitaciones
El medio OF o de fermentación de glucosa es un agar semi-sólido especialmente diseñado para el estudio del metabolismo oxidativo y fermentativo de los carbohidratos en un grupo importante de microorganismos diferente a las enterobacterias, denominados bacilos Gram negativos no entéricos.
Fue creado por Hugh y Leifson; estos investigadores se dieron cuenta de que los medios convencionales para el estudio de la producción de ácidos a partir de los carbohidratos no eran adecuados para este grupo específico de bacterias.
Esto se debe a que los bacilos Gram negativos no entéricos por lo general producen bajas cantidades de ácidos, a diferencia de las enterobacterias.
En este sentido, el medio OF cuenta con características especiales que pueden detectar las pequeñas cantidades de ácido formadas, tanto por la vía oxidativa como por la fermentativa. Estas diferencias están relacionadas con la cantidad de peptonas, carbohidratos y de agar.
Este medio contiene menos cantidad de peptonas y mayor concentración de carbohidratos, de esta manera se disminuyen los productos que alcalinizan el medio como resultado del metabolismo de las proteínas y se aumenta la producción de ácidos por el uso de los carbohidratos.
Por otra parte, la disminución de la cantidad de agar favorece la diseminación del ácido producido por todo el medio, además de que permite observar motilidad.
El medio OF está compuesto por peptona, cloruro de sodio, azul de bromotimol, fosfato dipotásico, agar y un carbohidrato. El carbohidrato más común es glucosa pero se pueden utilizar otros de acuerdo al que se quiera estudiar, tales como lactosa, maltosa, xilosa, entre otros.
Índice del artículo
Como todo medio de cultivo, el medio OF debe contener sustancias nutritivas que garanticen el crecimiento bacteriano; estas sustancias son las peptonas.
Por su parte, el carbohidrato proporciona energía y a la vez sirve para estudiar el comportamiento del microorganismo frente a él, es decir, permite clasificar a la bacteria como un organismo oxidativo, fermentativo o no sacarolítico.
El medio OF contiene una relación de peptona/carbohidrato de 1:5 a diferencia de los medios convencionales de 2:1. Esto garantiza que la cantidad de aminas alcalinas formadas a partir de la degradación de las peptonas no neutralice la formación de ácidos débiles.
Por otra parte, el medio contiene cloruro de sodio y fosfato dipotásico. Estos compuestos estabilizan osmóticamente al medio y regulan el pH respectivamente. El azul de bromotimol es el indicador de pH, el cual hace virar el color del medio de verde a amarillo con la producción de ácido.
Algunos microorganismos pueden utilizar los carbohidratos por la vía oxidativa o por la vía fermentativa, mientras que otros no toman ninguna de las dos vías.
Esto depende de la característica de cada microorganismo. Por ejemplo, algunos microorganismos aerobios estrictos pueden oxidar determinados carbohidratos, y los anaerobios facultativos pueden oxidar y fermentar dependiendo del ambiente que los rodee, mientras que otros no oxidan ni fermentan los carbohidratos (asacarolíticos).
Finalmente, existe una modificación del medio OF recomendada por la CDC que contiene una base especial OF con rojo fenol como indicador.
El proceso de oxidación de la glucosa no requiere la fosforilación de la glucosa, como ocurre en el proceso de fermentación. En este caso el grupo aldehído es oxidado a un grupo carboxilo, dando como resultado ácido glucónico. Este a su vez es oxidado a 2-cetoglucónico.
Este último o se acumula o se degrada a dos moléculas de ácido pirúvico. Este sistema necesita de la presencia de oxígeno o de algún compuesto inorgánico como aceptor final de electrones.
La producción de ácidos por esta vía es más débil que la obtenida por la vía fermentativa.
Para que ocurra la fermentación de la glucosa por cualquiera de las vías disponibles, esta debe ser primero fosforilada, pasando a ser glucosa-6-fosfato.
La fermentación de la glucosa puede tomar varías vías, la principal es la vía de Embden-Meyerhof- Parnas, pero también pueden tomar la vía de Entner-Doudoroff, o la vía de la hexosa monofosfato de Warburg-Dickens, también conocida como la vía de la degradación de las pentosas.
La vía elegida dependerá del sistema enzimático que posea el microorganismo.
Vía de Embden-Meyerhof- Parnas
En la fermentación de la glucosa por la vía de Embden-Meyerhof- Parnas, esta es desdoblada a dos moléculas de triosa, para luego ser degradados a diversos compuestos carbonados, hasta llegar a la formación de gliceraldehído-3-fosfato. A partir de allí se origina una sustancia intermediaria, que es el ácido pirúvico.
De allí se formarán diversos tipos de ácidos mixtos que pueden variar de una especie a otra.
Este sistema se da en ausencia de oxígeno y necesita un compuesto orgánico como aceptor final de electrones.
Vía de Entner-Doudoroff
En la fermentación de la glucosa por la vía de Entner-Doudoroff, la glucosa 6-fosfato pasa a glucono-ᵼ-lactona-6-fosfato y de allí es oxidada a 6-fosfogluconato y 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato, para finalmente formar ácido pirúvico. Esta vía sí necesita del oxígeno para que haya glucólisis.
Vía de la degradación de las pentosas o vía de la Hexoxa monofosfato de Warburg-Dickens
Esta vía es un híbrido de las 2 anteriores. Comienza similar a la vía Entner-Doudoroff, pero posteriormente se forma gliceraldehído-3-fosfato como precursor del ácido pirúvico, tal como ocurre en la vía de Embden-Meyerhof- Parnas.
Pesar:
2 gr de peptona
5 gr de cloruro de sodio
10 gr de D-glucosa (o del carbohidrato que se vaya a preparar)
0,03 gr de azul de bromotimol
3 gr de agar
0,30 gr de fosfato dipotásico
1 litro de agua destilada.
Mezclar todos los compuestos menos el hidrato de carbono y disolver en 1 litro de agua destilada. Calentar y agitar hasta disolver en su totalidad.
Al enfriar a 50°C se agrega 100 ml de glucosa al 10% (filtrada).
Distribuir asépticamente 5 ml del medio OF en tubos de ensayos con tapa de algodón y autoclavar a 121 °C, a 15 libras de presión por 15 minutos.
Dejar solidificar en posición vertical.
El pH del medio debe quedar en 7, 1. El color del medio preparado es verde.
Conservar en nevera.
El medio OF es un medio especial para determinar el comportamiento metabólico de un microorganismo frente a un carbohidrato. Especialmente para aquellos que forman ácidos de forma escasa, débil o nula.
Para cada microorganismo se necesitan 2 tubos OF, ambos deben ser inoculados con el microorganismo a estudiar. Se toma la colonia con un asa recta y se hace una punción en el centro del tubo sin llegar al fondo; se pueden hacer varias punciones, siempre y cuando no interese observar motilidad.
A uno de los tubos se le agrega una capa de vaselina líquida estéril o parafina fundida estéril (1 a 2 ml aproximadamente) y se rotula con la letra “F”. El otro tubo se deja original y se rotula con la letra “O”. Se incuban ambos tubos a 35°C y se observa diariamente hasta por 3 a 4 días.
Metabolismo y producción de gas
Tabla: Clasificación de los microorganismos de acuerdo a su comportamiento en los tubos OF abierto (oxidativo) y cerrado (fermentativo)
El gas se observa con la formación de burbujas o desplazamiento del agar.
Cabe destacar que un organismo que solamente oxide la glucosa pero no la fermente, tampoco podrá fermentar a otros carbohidratos, en todo caso solo lo oxidará. Por tanto, en esta situación se omitirá el tubo sellado para el estudio de otros carbohidratos.
Motilidad
Adicionalmente, en el medio OF se puede apreciar la motilidad.
Motilidad positiva: crecimiento que no se limita a la zona de inoculación. Hay crecimiento hacia los laterales del tubo.
Motilidad negativa: crecimiento únicamente en el inóculo inicial.
Como controles de calidad se pueden utilizar las siguientes cepas: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Moraxella sp. Los resultados esperados son:
- coli: Fermentador de glucosa (ambos tubos amarillos y con gas).
- aeruginosa: Oxidador de glucosa (tubo abierto amarillo y el sellado verde o azul).
- Moraxella sp: No sacarolítico (tubo abierto verde o azul, tubo sellado verde).
-Algunos microorganismos no pueden crecer en el medio OF. En estos casos se repite la prueba pero se le agrega al medio 2% de suero o 0,1% de extracto de levadura.
-Las reacciones de oxidación a menudo solo se observan cercana a la superficie y el resto del medio puede quedar verde, de igual manera se toma como positivo.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
- Mac Faddin J. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. 3era ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Laboratorios Francisco Soria Melguizo. 2009. OF Glucosa Medium. Disponible en: http://f-soria.es
- Laboratorios Conda Pronadisa. Medio OF glucosa. Disponible en: condalab.com
- Laboratorios BD. 2007. OF Basal Medium. Disponible en: bd.com