Citoquímica: historia, objeto de estudio, utilidad y técnicas
La citoquímica comprende una serie de técnicas que se fundamentan en la identificación y disposición de ciertas sustancias específicas en el interior de la célula. Se considera una rama de la biología celular que combina la morfología de la célula con la estructura química.
Según Bensley, fundador de la aplicación de la citología moderna, expresa que la finalidad de la citoquímica es descubrir la organización química de las células para poder comprender los misterios de la vida. Así como también estudiar los cambios dinámicos que ocurren durante los distintos estadios funcionales.
De esta manera es posible determinar el papel metabólico que cumplen estas sustancias dentro de la célula.
La citoquímica utiliza dos métodos principales. El primero se basa en procedimientos químicos y físicos. Estas técnicas recurren al uso del microscopio como instrumento indispensable para visualizar las reacciones químicas ocurridas sobre sustancias específicas dentro de la célula.
Ejemplo: el uso de colorantes citoquímicos, tales como la reacción de Feulgen o reacción de PAS, entre otras.
El segundo método se fundamenta en la bioquímica y en la microquímica. Con esta metodología es posible determinar cuantitativamente la presencia de sustancias químicas intracelulares.
Entre las sustancias que se pueden poner en evidencia en un tejido o estructura celular están los siguientes: proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos.
Índice del artículo
- 1 Historia de la citoquímica
- 2 ¿Qué estudia?
- 3 Utilidad
- 4 Técnicas en citoquímica
- 4.1 – Uso de colorantes
- 4.2 – Detección de lípidos por medio de colorantes liposolubles
- 4.3 – Tinción de grupos aldehídos (tinción del ácido peryódico de Schiff)
- 4.4 – Tinciones citoquímicas para estructuras proteicas
- 4.5 – Tinciones citoquímicas que utilizan sustratos para evidenciar la presencia de enzimas
- 4.6 – Coloraciones tricrómicas
- 4.7 – Colorantes que tiñen organelos específicos
- 4.8 – Otras técnicas utilizadas en citoquímica
- 5 Recomendaciones
- 6 Referencias
Las técnicas citoquímicas desde su invención han ayudado a comprender la composición de las células, y a través del tiempo han surgido una variedad de técnicas que utilizan diversos tipos de colorantes con afinidades y fundamentos disímiles.
Posteriormente, la citoquímica abrió nuevos horizontes con el uso de determinados sustratos para evidenciar colorimétricamente la presencia de enzimas u otras moléculas dentro de la célula.
Así mismo, han surgido otras técnicas como la inmunocitoquímica que ha sido de gran ayuda para el diagnóstico de muchas enfermedades. La inmunocitoquímica se basa en reacciones antígeno-anticuerpo.
Por otra parte, la citoquímica también ha utilizado sustancias fluorescentes denominadas fluorocromos, que son excelentes marcadores para la detección de ciertas estructuras celulares. Debido a las características del fluorocromo, destaca las estructuras a la que se ha fijado.
Las diversas técnicas citoquímicas utilizadas sobre una muestra biológica tienen algo en común: poner en evidencia la presencia de un tipo específico de sustancia y conocer su localización dentro de la estructura biológica en evaluación, bien sea un tipo celular o un tejido.
Estas sustancias pueden ser enzimas, metales pesados, lípidos, glucógeno y grupos químicos definidos (aldehídos, tirosina, etc.).
La información aportada por estas técnicas puede orientar no solo para la identificación de células, sino también para el diagnóstico de diversas patologías.
Por ejemplo, las tinciones citoquímicas son muy útiles para diferenciar entre los diversos tipos de leucemias, ya que algunas células expresan ciertas enzimas o sustancias claves y otras no.
Por otra parte, cabe destacar que para que sea posible el uso de la citoquímica se deben tomar las siguientes consideraciones:
1) La sustancia debe ser inmovilizada en el lugar donde esta se encuentra naturalmente.
2) La sustancia debe identificarse usando sustratos que reaccionan de forma específica con ella y no con otros compuestos.
Las muestras que pueden ser estudiadas a través de las técnicas citoquímicas son:
– Extendidos de sangre periférica.
– Extendidos de médula ósea.
– Tejidos fijados para técnicas de histoquímica.
– Células fijadas por citocentrifugación.
Las técnicas citoquímicas son de gran apoyo en el área de hematología, pues son muy utilizadas para ayudar en el diagnóstico y diferenciación de ciertos tipos de leucemias.
Por ejemplo: Las reacciones de esterasas sirven para diferenciar entre una leucemia mielomonocítica de una leucemia monocítica aguda.
Los frotis de médula ósea y sangre periférica de estos pacientes se parecen, ya que algunas células son difíciles de identificar sólo desde el punto de vista morfológico. Para ello se realiza la prueba de esterasa.
En la primera dan positivas las esterasas específicas, mientras que en la segunda dan positiva las esterasas inespecíficas.
También son de gran utilidad en histología, ya que por ejemplo el uso de la técnica de coloración con metales pesado (impregnación argéntica), tiñe las fibras reticulares de color marrón intenso en el tejido miocárdico.
A continuación se explicarán las técnicas más usadas:
Los colorantes utilizados son muy diversos en las técnicas citoquímicas y estos pueden clasificarse según varios puntos de vistas:
De acuerdo al radical por el que tienen afinidad
Se dividen en: ácidos, básicos o neutros. Son los más sencillos y los más utilizados a través de la historia, permitiendo distinguir los componentes basófilos de los acidófilos. Ejemplo: la coloración hematoxilina-eosina.
En este caso, los núcleos de las células se tiñen de azul (toman la hematoxilina que es el colorante básico) y los citoplasmas de rojo (toman la eosina que es el colorante ácido).
Según el color que proporcionan
Pueden ser ortocromático o metacromáticos. Los ortocromáticos son aquellos que tiñen las estructuras del mismo color que posee el colorante. Por ejemplo, el caso de la eosina, cuyo color es rojo y tiñe de rojo.
Los metacromáticos en cambio tiñen las estructuras de un color diferente al de ellos, como por ejemplo la toluidina, cuya color es el azul y, sin embargo, tiñe de violeta.
Colorantes vitales o supravitales
Son colorantes inocuos, es decir, que colorean a las células y estas se mantienen vivas. A estos colorantes se les llama vitales (ej: el azul de tripán para teñir macrófagos) o supravitales (ej: el verde de Janus para teñir mitocondrias o el rojo neutro que tiñe los lisosomas).
Tetróxido de osmio
Tiñe a los lípidos (ácidos grasos no saturados) de color negro. Esta reacción puede observarse con el microscopio óptico, pero debido a que este colorante es de alta densidad también puede ser visualizado con microscopio electrónico.
Sudán III
Es uno de los más utilizados. Este colorante se difunde y solubiliza en los tejidos, acumulándose en el interior de las gotas de lípido. El color es rojo escarlata.
Tinción de Sudán negro B
Produce mejor contraste que los anteriores debido a que es capaz de disolverse también en los fosfolípidos y en el colesterol. Es útil para detectar gránulos azurófilos y específicos de los granulocitos maduros y de sus precursores. Por tanto identifica a las leucemias mieloides.
La tinción de ácido peryódico de Schiff puede detectar tres tipos de grupos aldehídos. Ellos son:
– Los aldehídos libres, presentes naturalmente en los tejidos (reacción plasmal).
– Aldehídos producidos por oxidación selectiva (reacción de PAS).
– Aldehídos generados por hidrólisis selectiva (reacción de Feulgen).
Reacción del PAS
Esta tinción se basa en detectar ciertos tipos de carbohidratos, como por ejemplo el glucógeno. El ácido peryódico de Schiff rompe los enlaces C-C de los carbohidratos debido a la oxidación de los grupos glicólicos 1-2, logrando liberar grupos aldehídos.
Los grupos de aldehídos libres reaccionan con el reactivo de Schiff y forman un compuesto de color rojo púrpura. La aparición del color rojo púrpura evidencia una reacción positiva.
Esta prueba da positiva en células vegetales, detectando almidón, celulosa, hemicelulosa y peptinas. Mientras que en células animales detecta mucinas, mucoproteínas, ácido hialurónico y quitina.
Además, es útil en el diagnóstico de leucemias linfoblásticas o eritroleucemia, entre otras patologías del tipo mielodisplásicas.
En el caso de hidratos de carbono ácidos se puede utilizar la tinción de azul alcián. La prueba es positiva si se observa un color celeste/turquesa.
Reacción plasmal
La reacción plasmal pone en evidencia la presencia de ciertos aldehídos alifáticos de cadena larga como el palmital y el estearal. Esta técnica se aplica sobre cortes histológicos congelados. Se trata de forma directa con el reactivo de Schiff.
Reacción de Feulgen
Esta técnica detecta la presencia de ADN. La técnica consiste en someter al tejido fijado a una hidrólisis ácida débil para posteriormente hacerlo reaccionar con el reactivo de Schiff.
La hidrólisis deja expuesto los grupos aldehídos de la desoxirribosa a nivel de la unión desoxirribosa-purina. Luego, el reactivo de Schiff reacciona con los grupos aldehídos que quedaron libres.
Esta reacción da positiva en los núcleos y negativa en los citoplasmas de las células. La positividad se evidencia por la presencia de un color rojo.
Si esta técnica se combina con el verde de metilo-pironina es posible detectar de forma simultánea el ADN y el ARN.
Para ello se puede utilizar la reacción de Millon, la cual se utiliza como reactivo el nitrato de mercurio. Las estructuras que contengan aminoácidos aromáticos se teñirán de color rojo.
Estas tinciones se basan en la incubación de la muestra biológica con un sustrato determinado y el producto de la reacción reacciona posteriormente con sales diazoicas para formar un complejo coloreado.
Esterasas
Estas enzimas están presentes en los lisosomas de algunas células hemáticas y son capaces de hidrolizar los ésteres orgánicos liberando naftol. Este último forma un azocolorante insoluble cuando se une a una sal diazoica, tiñendo el lugar donde ocurre la reacción.
Existen varios sustratos y dependiendo cual se use se pueden identificar esterasas específicas y esterasas inespecíficas. Las primeras están presentes en las células inmaduras de la serie mieloide y las segundas en las células de origen monocíticas.
El sustrato utilizado para la determinación de esterasas específicas es: el naftol-AS-D cloroacetato. Mientras que para la determinación de esterasas inespecíficas se pueden usar varios sustratos como el naftol AS-D acetato, el alfa naftil acetato y el alfa naftil butirato.
En ambos casos las células se teñirán de color rojo intenso cuando la reacción sea positiva.
Mieloperoxidasa
Esta enzima se encuentra en los gránulos azurófilos de las células granulocíticas y de los monocitos.
Su detección se utiliza para diferenciar las leucemias de origen mieloide respecto de las linfoides. Las células que contienen mieloperoxidasas se colorean de amarillo ocre.
Fosfatasas
Estas enzimas liberan ácidos fosfóricos de distintos sustratos. Se diferencian entre sí de acuerdo a la especificidad del sustrato, el pH y la acción de inhibidores e inactivadores.
Entre las más conocidas están las fosfomonoesterasas que hidrolizan ésteres simples (P-O). Ejemplo: la fosfatasa alcalina y la fosfatasa ácida, así como las fosfamidasas que hidrolizan las uniones (P-N). Estas son usadas para diferenciar síndromes linfoproliferativos y para el diagnóstico de tricoleucemia.
Tricrómico de Mallary-Azan
Son útiles para diferenciar el citoplasma de las células de las fibras del tejido conectivo. Las células se tiñen de rojo y las fibras colágenas de azul.
Tricrómico de Masson
Esta tiene la misma utilidad que la anterior pero, en este caso, las células se tiñen de rojo y las fibras colágenas de verde.
Verde de Janus
Este tiñe selectivamente a las mitocondrias.
Sales de plata y ácido ósmico
Tiñe al aparato de Golgi.
Azul de toluidina
Tiñe los cuerpos de Nissi
Sales de plata y PAS
Tiñen las fibras reticulares y la lámina basal.
Orceína y fucsina resorcina
Tiñen las fibras elásticas. Con la primera se tiñen de color café y con la segunda de color azul o morado intenso.
Uso de sustancias fluorescentes o fluorocromos
Existen técnicas que utilizan sustancias fluorescentes para estudiar la localización de una estructura en una célula. Estas reacciones son visualizadas con microscopio especiales llamados de fluorescencia. Ejemplo: técnica de IFI (Inmunofluorescencia indirecta).
Detección de componentes celulares mediante inmunocitoquímica
Estas técnicas son de gran utilidad en medicina ya que ayudan a detectar cierta estructura celular y también la cuantifica. Esta reacción se basa en una reacción antígeno-anticuerpo. Por ejemplo: las técnicas de ELISA (Enzima Inmuno Ensayo).
– Es necesario usar frotis controles para evaluar el buen funcionamiento de los colorantes.
– Se debe usar frotis frescos para ser sometidos a coloraciones citoquímicas. De no ser posible se deben mantener protegidos de la luz y conservados a 4 °C.
– Se debe cuidar que el fijador utilizado no influya negativamente sobre la sustancia a investigar. Es decir, se debe evitar que este sea capaz de extraerla o inhibirla.
– Se debe respetar el tiempo de uso de los fijadores, pues por lo general sólo debe durar segundos, ya que exponer el frotis más tiempo al fijador puede dañar algunas enzimas.
- “Citoquímica.” Wikipedia, La enciclopedia libre. 30 jun 2018, 17:34 UTC. 9 jul 2019, 02:53 Disponible en: wikipedia.org
- Villarroel P, de Suárez C. Métodos de Impregnación Metálica para el Estudio de las Fibras Reticulares Miocárdicas: Estudio comparativo. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Disponible en: scielo.org
- Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Citoquímica de la fosfatasa ácida: Consideraciones metodológicas. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2):89-92. Disponible en: scielo.org
- De Robertis E, De Robertis M. (1986). Biología celular y molecular. 11 va edición. Editorial Ateneo. Buenos Aires, Argentina.
- Herramientas clásicas para el estudio en biología celular. TP 1 (material complementario) – Biología Celular. Disponible en: dbbe.fcen.uba.ar