Caldo malonato: fundamento, preparación y usos
El caldo malonato es el medio de cultivo líquido empleado para la prueba diagnóstica (prueba del malonato), utilizado para diferenciar algunos géneros de la familia Enterobacteriaceae. Fue creado por Leifson en 1.933 y modificado posteriormente por Ewing, el cual le agregó una pequeña cantidad de dextrosa y extracto de levadura a la fórmula original.
El medio actualmente está compuesto por extracto de levadura, sulfato de amonio, fosfato dipotásico, fosfato monopotásico, cloruro de sodio, malonato de sodio, dextrosa y azul de bromotimol. Esta prueba se incluye generalmente en la batería bioquímica de identificación para Enterobacterias, ayudando a la diferenciación de ciertos géneros y especies.
La prueba de malonato se basa principalmente en la capacidad que tienen algunos microorganismos de utilizar como única fuente de carbono al malonato de sodio y como fuente de nitrógeno al sulfato de amonio.
La prueba de malonato suele dar positiva en algunas especies de los géneros Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. En tanto que, la mayoría de las especies de los géneros Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus y Providencia, dan reacción negativa.
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La prueba del malonato consiste en evidenciar aquellas bacterias que son capaces de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono y el sulfato de amonio como fuente de nitrógeno.
La mayoría de las enterobacterias que no utilizan el malonato son capaces de crecer en este medio, tomando como nutrientes la dextrosa y el extracto de levadura.
En este caso, cualquier intento de alcalinización por el uso de las peptonas será contrarrestada por la producción de ácidos generados por la fermentación de la dextrosa. Así mismo, los fosfatos dipotásico y monopotásico actúan como tampón manteniendo el pH a 6,7.
Es por ello que, cuando la prueba es negativa, el caldo queda del mismo color original (verde). En raras ocasiones el medio podría acidificarse debido a la fermentación de la dextrosa; sin el uso de las peptonas y el indicador de pH haría virar el color del medio hacia amarillo. Para que ello ocurra el pH debe bajar a 6.
Ahora bien, cuando esta prueba es positiva se dice que el microorganismo utilizó el malonato y al sulfato de amonio como fuentes de carbono y nitrógeno respectivamente, sin hacer uso de los otros componentes.
En este caso el medio se alcaliniza debido a la liberación del sodio y la consecuente formación de NaOH. En este sentido, el indicador de pH (azul de bromotimol) hace virar el color del medio de verde hacia azul cuando el pH es igual o mayor a 7,6. El azul puede ser claro o intenso (azul de Prusia).
Finalmente, el cloruro de sodio mantiene la osmolaridad del medio y el agua es el diluente de todos los componentes.
Caldo del mismo color (verde): prueba negativa
Caldo amarillo: prueba negativa
Caldo azul claro o intenso: prueba positiva
Existe una variante denominada caldo fenilalanina malonato, también llamado medio de Shaw y Clarke. En este caso se pueden analizar dos pruebas, el uso del malonato como fuente de carbono y la producción de ácido pirúvico a partir de la fenilalanina.
Se pesa la cantidad de gramos que especifique el inserto de la casa comercial elegida (puede variar de una a otra). Los gramos pesados se suspenden en un litro de agua destilada. Calentar ligeramente hasta su completa disolución. Distribuir 3 ml del medio en tubos de ensayo 13/100 con tapa de algodón.
Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 o 20 minutos.
Enfriar antes de usar. Si no van a ser usados inmediatamente, guardar en nevera hasta su uso. Atemperar los caldos a temperatura ambiente antes de inocularlos.
El pH del medio debe quedar en 6,7 ± 0,2. El color del medio preparado es verde botella.
Pesar 11 gr del medio deshidratado y disolver en 1 litro de agua destilada. El resto de la preparación igual a la anteriormente descrita.
También se puede preparar agregando 2 gr/L de fenilalanina al medio de caldo malonato antes de que sea esterilizado.
Se utiliza como parte de la batería de pruebas bioquímicas que se montan para la identificación de bacterias de la familia Enterobacteriaceae.
Ayuda a distinguir entre:
-El género Klebsiella y Enterobacter (+) del género Escherichia y Serratia (-).
-Las especies de Salmonella entérica ssp arizonae, Salmonella entérica ssp salame y Salmonella enterica ssp diarizonae (+), de la especie Salmonella enterica ssp enterica (-).
-Del género Klebsiella generalmente (+) del género Actinobacillus (-).
-En ocasiones puede ayudar a la diferenciación de géneros y especies de bacterias no pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, como entre los bacilos Gram negativos no fermentadores Alcaligenes faecalis (+) y Acinetobacter sp (-).
Bajo un mechero, se toma una porción de una colonia pura, utilizando un asa de platino debidamente esterilizada y enfriada. La muestra tomada (inóculo liviano) se disuelve en el caldo malonato. Se incuba con la tapa floja en aerobiosis a 35°C ± 0,2 por 24 a 48 horas.
También se pueden inocular el caldo malonato a partir de un cultivo de 18 – 24 horas en caldo soya tripticasa. En este caso se toma 0,01 ml con una pipeta estéril y se inocula el caldo malonato. Se incuba con la tapa floja en aerobiosis a 35°C ± 0,2 por 24 a 48 horas.
Finalizado el tiempo se interpretan los resultados. Cualquier vestigio de color azul culminado las 48 horas de incubación debe considerarse positiva. No se debe interpretar la prueba como negativa hasta que no se haya cumplido el tiempo de incubación de 48 horas.
En el caso de utilizar la variante caldo fenilalanina malonato, primero se interpreta el malonato y luego se agregan 5 gotas de HCL 1N y 3-5 gotas de cloruro férrico 8%. Un color verde oscuro se interpreta como una prueba positiva para fenilalanina. Si por el contrario el medio se torna azul pálido la prueba es negativa para fenilalanina.
Para realizar el control de esterilidad del medio se deben incubar uno o dos caldos a 35°C ± 0,2 por 24 horas de incubación. Al cabo de este tiempo no debe haber turbidez, ni cambio de color.
Para el control de calidad se pueden usar cepas conocidas o certificadas, tales como: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella entérica ssp arizonae ATCC 13314 y Escherichia coli ATCC 25922.
Los resultados esperados son:
- Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae y Salmonella entérica ssp arizonae dan reacción positiva (medio color azul).
- Para Escherichia coli el resultado debe dar negativo, es decir, se espera que no haya cambio de color (verde) o que vire a amarillo por la fermentación de la glucosa.
No usar caldo que muestren turbidez, precipitados, cambio de color o algún signo de deterioro.
- Pedraza J, Sanandres N, Varela Z, Aguirre E, Camacho J. Aislamiento microbiológico de Salmonella spp. y herramientas moleculares para su detección. Salud Uninorte. Barranquilla (Col.) 2014; 30 (1): 73-94. Disponible en: scielo.org.co
- BBL. Malonate Broth, Ewing modified. 2007. Disponible en: bd.com
- Laboratorios Senna. Caldo Malonato. Disponible en: cientificasenna.com
- RenyLab. Caldo Malonato. 2013. Disponible en: es.renylab.ind.br
- Mbiolog Diagnósticos. Caldo Malonato. Disponible en: mbiolog.com
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
- Laboratorios Conda Pronadisa. Caldo fenilalanina malonato. Disponible en: condalab.com