Agar TSI: fundamento, preparación y usos
El agar TSI o agar hierro triple azúcar es un medio de cultivo sólido que sirve como prueba bioquímica para orientar la identificación inicial de los bacilos Gram negativos. Se fundamenta en evidenciar la fermentación de los azúcares presentes, y la producción de sulfuro de hidrógeno y gas.
Su composición y fundamento es muy similar a la prueba de Kligler hierro, con la diferencia que este último contiene solo glucosa y lactosa. En cambio, -como su nombre lo indica- el agar hierro triple azúcar contiene tres carbohidratos fermentables: glucosa, lactosa y sacarosa.
Además, el medio TSI posee cuatro derivados proteicos que lo hacen ser un agar muy nutritivo: extracto de levadura, extracto de carne, peptona y proteosa peptona. También contiene sulfato ferroso de amonio, tiosulfato de sodio, cloruro de sodio, rojo de fenol y agar.
La incapacidad de un microorganismo en fermentar la glucosa presente en el medio lo excluye inmediatamente de pertenecer a la Familia Enterobacteriaceae. De allí que esta prueba es esencial para decidir qué ruta de identificación se debe tomar para determinar el género y la especie.
Cada laboratorio decide si trabaja con agar TSI o con agar Kligler hierro.
Índice del artículo
- 1 Fundamento
- 1.1 Cloruro de sodio y agar
- 1.2 Indicador de pH (rojo de fenol)
- 1.3 Derivados proteicos (extracto de levadura, extracto de carne, peptona y proteosa peptona)
- 1.4 Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa y sacarosa)
- 1.5 Producción de gas
- 1.6 Tiosulfato de sodio y sulfato ferroso de amonio (producción de sulfuro de hidrógeno)
- 2 Preparación
- 3 Usos
- 4 Sembrado
- 5 Limitaciones
- 6 Referencias
Cada uno de los compuestos cumple una función dentro del medio.
El cloruro de sodio es necesario para mantener el equilibrio osmótico del medio. En tanto que el agar le da la consistencia sólida.
El pH del medio preparado está equilibrado a 7,3 y el indicador de pH (rojo de fenol) vira a amarillo por debajo de 6,8. Esto quiere decir que pequeñas cantidades de ácidos producidos por la fermentación de los azúcares harán virar el medio de color rojo-naranja a amarillo.
Si no ocurre fermentación habrá alcalinización del medio por el uso de las peptonas, virando de rojo-naranja a rojo fuerte.
Cuando las bacterias metabolizan las proteínas presentes en el agar TSI, se producen aminas que alcalinizan el medio (principalmente a nivel del bisel), debido a que la reacción necesita oxígeno. Las aminas hacen virar el bisel a rojo fuerte.
Pero esto dependerá de la capacidad que tengan las bacterias de fermentar o no los carbohidratos.
El estudio de la fermentación de azúcares puede dar varias imágenes y cada una se interpreta de manera diferente. La interpretación de la prueba divide a los microorganismos en 3 categorías: no fermentadores de glucosa, no fermentadores de lactosa y fermentadores de lactosa/sacarosa.
Cabe destacar que la cantidad de glucosa en el medio es limitada, mientras que la concentración de lactosa y sacarosa es 10 veces mayor.
Las bacterias de la Familia Enterobacteriaceae y otros microorganismos fermentadores de glucosa comenzarán a fermentar este azúcar por ser el carbohidrato más simple para obtener energía.
Por otra parte, la lactosa y la sacarosa son carbohidratos complejos que deben ser descompuestos y convertidos en glucosa para que puedan ingresar al ciclo de Embden-Meyerhof.
-Microorganismos no fermentadores de glucosa
Cuando el microorganismo inoculado no es capaz de fermentar la glucosa, mucho menos podrá fermentar otros carbohidratos. Por tanto, aquí no se forman ácidos, pero existe formación de aminas en el bisel por la utilización de las peptonas.
En este caso el bisel vira a un rojo más fuerte y el fondo del tubo puede quedar sin cambio o puede alcalinizarse también, quedando todo el tubo rojo.
Interpretación: K/K significa bisel alcalino / fondo alcalino o neutro
En la imagen que se encuentra al inicio del artículo véase la imagen del tubo D.
Este resultado indica que el microorganismo no pertenece a la Familia Enterobacteriaceae.
-Microorganismos no fermentadores de lactosa/sacarosa
Si la bacteria es capaz de fermentar la glucosa pero no la lactosa ni la sacarosa, pasará lo siguiente:
La bacteria consumirá toda la glucosa presente al cabo de 6 a 8 horas aproximadamente, siendo capaz de acidificar tanto el bisel como el taco; es decir, el agar habrá virado completamente a amarillo. Pero al agotarse la glucosa y ante la imposibilidad de utilizar la lactosa y la sacarosa, la bacteria comenzará el metabolismo de las proteínas.
Esta reacción necesita oxígeno, por ello la degradación de las peptonas se da en la superficie (bisel). Las aminas producidas alcalinizan el bisel virando de color amarillo a rojo. Esta reacción es evidenciada a las 18 a 24 horas de incubación.
Interpretación: K/A significa bisel alcalino y taco ácido.
En la imagen que se encuentra al inicio del artículo véase la imagen del tubo B.
-Microorganismos fermentadores de lactosa/sacarosa
Los microorganismos capaces de fermentar la lactosa y la sacarosa obviamente pueden fermentar la glucosa. Después de que la mínima cantidad de glucosa presente en el medio se agota, el piruvato formado se comienza a metabolizar para formar ácidos a través del ciclo aeróbico de Krebs, y en el período de 8 a 12 horas todo el medio estará amarillo.
Si la bacteria es capaz de desdoblar la lactosa o la sacarosa, se seguirán produciendo ácidos, y al cabo de 18 a 24 horas todo el tubo –bisel y taco- continuarán amarillos.
Cabe destacar que la utilización de la glucosa se realiza de dos maneras: una en forma aerobia en el bisel del tubo, y la otra de forma anaerobia en el fondo del tubo.
Interpretación: A/A significa bisel ácido/ fondo ácido. Puede presentar gas o no.
En la imagen que se encuentra al inicio del artículo véase la imagen del tubo A.
Algunos microorganismos son capaces de producir gas durante la fermentación de los azúcares. El gas se evidencia en el tubo por la presión que este ejerce dentro del agar. La presión origina la formación de burbujas o el desplazamiento del agar. En ocasiones la formación de gas puede fracturar al medio.
Es importante que al momento de sembrar el medio TSI, la punción se haga limpiamente por el centro del agar hasta llegar al fondo. Si la punción se desvía hacia las paredes del tubo, puede causar falsos positivos en la producción del gas, ya que el mismo escapará por el canal formado erróneamente.
La producción de gas, así como las reacciones que ocurren en el bisel del agar, necesitan oxígeno, por tanto se recomienda que el tubo sea tapado con tapón de algodón, y si se usa tapa de baquelita, esta no debe estar ajustada completamente.
La producción de gas se reporta como positiva (+) o negativa (-).
Las bacterias capaces de producir sulfuro de hidrógeno (gas incoloro), toman el azufre del tiosulfato de sodio presente en el medio. Una vez formado el H2S reacciona con el sulfato ferroso de amonio, produciendo sulfuro de hierro (precipitado negro claramente visible).
La producción de H2S se reporta como positiva (+) o negativa (-).
En la imagen que se encuentra al inicio del artículo véase la imagen del tubo C.
Pese 62,5 gr del medio agar hierro triple azúcar (TSI) deshidratado y disuelva en un litro de agua destilada.
Caliente hasta disolver completamente el agar. Hervir por un minuto agitando frecuentemente. Distribuir 4 ml del medio en tubos de ensayo 13/100 con tapa de algodón.
Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos. Sacar del autoclave y dejar reposar de forma inclinada. Se debe cuidar que tanto la base como el bisel tengan la misma distancia.
Almacenar en nevera 2-8°C. Dejar atemperar antes de sembrar la cepa bacteriana.
El color del medio deshidratado es beige claro y el medio preparado es de color rojo-naranja
El pH final del medio preparado es 7,3 ± 0,2.
La prueba TSI es muy utilizada a nivel del laboratorio de microbiología. Esta prueba resulta indispensables para orientar el tipo de prueba que debe aplicarse para llegar a la identificación del género y especie. Su buena ejecución e interpretación puede hacer ahorrar material y trabajo.
Si el resultado es un TSI K/K y la prueba citocromo oxidasa da positivo, se sabe que deben usarse pruebas para la identificación de bacilos Gram negativos no fermentadores, tales como Pseudomonas, Alcalígenes, Achromobacter, Burkholderia, entre otros géneros. Si es oxidasa negativo se orienta hacia los géneros Acinetobacter, Stenotrophomonas, etc.
En cambio, si se obtiene un TSI A/A o K/A y la prueba citocromo oxidasa es negativa, más reducen los nitratos a nitritos, tendremos certeza que se trata de un microorganismo perteneciente a la Familia Enterobacteriaceae. En este caso la ruta de identificación se orientará a pruebas específicas para este grupo de bacterias.
Por otra parte, si se obtiene una imagen K/A o A/A y la prueba citocromo oxidasa es positiva, las pruebas adicionales a montar irán dirigidas a la identificación de cepas fermentadoras que no pertenecen a la Familia Enterobacteriaceae, tales como: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio y Pasteurella.
Un TSI con sulfuro de hidrógeno, oxidasa negativa, orientará a la identificación de los siguientes géneros de la Familia Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella o Salmonella.
Un TSI con sulfuro de hidrógeno escaso o moderado en el bisel alcalino con fondo alcalino y una oxidasa positiva, orientará a utilizar pruebas para la identificación de bacilos Gram negativos no fermentadores productores de H2S, tal como Shewanella putrefaciens.
Finalmente, el TSI puede ser utilizado para la investigación de la producción de sulfuro de hidrógeno en bacilos Gram positivos, especialmente cuando se sospecha de Erysipelothrix rhusiopathiae.
El medio TSI debe ser inoculado con colonias puras, aisladas en cultivos primarios o selectivos. Si la colonia se toma de medios selectivos que fueron sembrados con muestras con flora mixta, se debe tener el cuidado de tomar solo de la superficie, ya que en la parte inferior de la colonia pueden existir cepas viables inhibidas en ese medio.
Por tanto, no se debe jamás enfriar el asa en un medio selectivo para luego tomar la colonia e inocular un medio TSI.
El sembrado se realizará con un ansa recta o aguja. Se realizará una punción, cuidando que sea por el centro del medio hasta llegar al fondo, y luego se termina el sembrado inoculando la superficie en forma de zigzag. No hacer dos punciones.
Incubar a 37°C en aerobiosis por 18-24 horas. Interpretar en este tiempo, ni antes, ni después.
La prueba de TSI se debe leer entre 18 a 24 horas de incubación. Una lectura antes de este tiempo puede dar un falso positivo de fermentación A/A. En tanto que, una lectura posterior a este tiempo, puede dar lugar a una imagen falsa negativa de no fermentador, debido al consumo de las peptonas que alcalinizan el medio.
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- “Agar TSI.” Wikipedia, La enciclopedia libre. 10 jul 2018, 08:09 UTC. 10 feb 2019, 03:33 Disponible en: es.wikipedia.org
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