ADN recombinante: técnica, aplicaciones y fundamentos
El ADN recombinante (ADNr o rDNA) es una molécula artificial de ácido nucleico creada en el laboratorio, mediante la integración de segmentos de interés de dos organismos. También es conocido como ADN quimérico, gracias a su propiedad híbrida. Este tipo de ADN no lo encontramos en la naturaleza.
La metodología básica para generarlo incluye: (a) la selección de un ADN blanco, y su inserción en otro fragmento de ADN (generalmente un plásmido bacteriano); (b) la introducción de este plásmido en una bacteria, (c) la selección de las bacterias por medio de antibióticos y finalmente (d) la expresión del gen.
La técnica saca provecho de un juego de enzimas que permiten copiar y pegar fragmentos específicos de ADN a juicio del investigador.
El objetivo de la tecnología recombinante es, en la mayoría de los casos, la expresión de una proteína (conocida como proteína recombinante) deseada por el biólogo molecular para futuras investigaciones o para crear una proteína de valor comercial y terapéutico – como la insulina humana, por ejemplo.
Índice del artículo
- 1 Fundamentos de la técnica del ADN recombinante y su utilización en la ingeniería genética
- 2 Técnica: ¿cómo se modifica de manera artificial el ADN de un organismo en laboratorio?
- 3 Aplicaciones
- 4 Referencias
Todos los seres orgánicos que conocemos comparten varias características. Una de ellas es la naturaleza del material genético y la manera en que se producen las proteínas – proceso conocido como el “dogma” central de la biología molecular.
Con excepción de una par de virus, todos los organismos almacenan la información genética en el ADN (ácido desoxirribonucleico), recogido de manera muy compacta y organizada en el núcleo de la célula.
Para la expresión de los genes, la molécula de ADN es transcrita al ARN mensajero, y este último es traducido al lenguaje de aminoácidos, los bloques estructurales de las proteínas.
Entre las décadas de los 70 y los 80, los biólogos moleculares empezaron a sacar provecho de los procesos que naturalmente ocurren en el interior de la célula y lograron extrapolarlos al laboratorio.
De esta manera, un gen de origen animal (un vertebrado, por ejemplo) podía ser insertado en un segmento de ADN proveniente de una bacteria; o bien el ADN de una bacteria podía ser combinado con un ADN viral. Así, podemos definir a un ADN recombinante como una molécula compuesta por ADN proveniente de dos organismos diferentes.
Una vez que se ha creado esta molécula híbrida o recombinante, se procede a la expresión del gen de interés. Con la palabra expresión queremos hacer referencia al proceso de traducción a proteína.
Un elemento clave para poder desarrollar la tecnología de ADN recombinante fue el descubrimiento de las enzimas de restricción.
Estas son moléculas proteicas que exhiben la capacidad de escindir al ADN (nucleasas) en secuencias concretas, sirviendo como unas “tijeras moleculares”. Los fragmentos generados por estas enzimas se denominan fragmentos de restricción.
Dichas enzimas pueden producir en la secuencia blanco cortes simétricos (en ambas cadenas a la misma altura) o cortes asimétricos. Un aspecto clave de la acción de las enzimas de restricción es que posterior a la escisión de las cadenas se obtiene un “borde suelto”, complementario al otro borde cortado por la misma enzima.
Algunos ejemplos son ECOR 1 y Sma 1. Actualmente se conocen más de 200 tipos de enzimas de restricción y están disponibles comercialmente.
Para ser de utilidad, una tijera debe venir acompañada del pegamento. Esta acción de sellado del ADN (previamente tratado con las enzimas de restricción) es llevada a cabo por las ligasas.
A continuación describiremos los pasos principales que requiere la tecnología de ADN recombinante. Todos son llevados a cabo por profesionales en un laboratorio de biología molecular.
Antes de continuar con el protocolo experimental, debemos acotar que en biología molecular y biotecnología es ampliamente usado el término “clon” y el verbo “clonar”. Esto podría llevar a confusión.
En este contexto, no nos referimos a la clonación de todo un organismo (como en el caso de la famosa oveja Dolly, por ejemplo), sino a la clonación de un fragmento de ADN, que puede ser un gen. Es decir, producir muchas copias – genéticamente idénticas – de la secuencia.
El primer paso es decidir qué secuencia desea ser utilizada. Esto depende totalmente del investigador y de los objetivos de su trabajo. Luego, se debe aislar y purificar este ADN. Los métodos y procedimientos para lograrlo dependen a su vez del organismo y del tejido.
Generalmente se toma una porción de tejido y se somete a un tratamiento en un tampón de lisis con proteinasa K (una enzima proteolítica) y luego se extrae el ADN. Posteriormente, se procede a la fragmentación del material genético en pequeños fragmentos.
Después de los pasos preparatorios, el investigador busca introducir el segmento de ADN de interés en un vector de clonación. De ahora en adelante a este segmento de ADN lo llamaremos ADN blanco.
Plásmidos
Uno de los vectores más usados en un plásmido de origen bacteriano. Un plásmido es una molécula de ADN circular de doble cadena que encontramos de manera natural en las bacterias. Son entes ajenos al cromosoma bacteriano – es decir, son extracromosomales, y se encuentran de manera natural en estos procariotas.
Los elementos básicos de un vector son: (a) un origen de replicación, que permite la síntesis de ADN; (b) agente de selección, que permite identificar a los organismos que portan el plásmido con el ADN blanco, como la resistencia a algún antibiótico; y (c) sitio de multiclonación, donde se encuentran las secuencias que serán reconocidas por las enzimas de restricción.
El primer ADN recombinante exitoso en el laboratorio fue clonado en el plásmido pSC101 proveniente de la bacteria E. coli. Este contiene un sitio de restricción para la enzima de restricción EcoRI y un gen de resistencia a un antibiótico, además del origen del replicación.
La inserción del ADN blanco en el plásmido se realiza utilizando las herramientas moleculares de enzimas de restricción y ligasas descritas en el apartado anterior.
Tipos de vectores restantes
Además de los plásmidos, el ADN puede ser insertado en otro vector, como el bacteriófago lambda, los cósmidos, los YAC (cromosomas artificiales de levadura), los BAC (cromosoma artificial bacteriano) y los fagémidos.
Una vez que se ha obtenido la molécula de ADN recombinante (gen de interés en el plásmido u otro vector) esta se introduce en un organismo anfitrión o huésped, que puede ser una bacteria.
Para introducir ADN foráneo en una bacteria se usa una técnica llamada transformación bacteriana, donde se somete al organismo a un tratamiento con cationes divalentes que lo hace susceptible a la toma de ADN.
Metodológicamente, no podemos asegurar que el 100% de las bacterias en nuestro cultivo han tomado de manera efectiva nuestra molécula de ADN recombinante. Es aquí donde entra en juego la porción del plásmido que contiene la resistencia al antibiótico.
Así, las bacterias que han tomado el plásmido serán resistentes a cierto antibiótico. Para seleccionarlas, bastará la aplicación de dicho antibiótico y tomar las sobrevivientes.
Después de seleccionar las bacterias con nuestro ADN recombinante, procedemos a usar la maquinaria enzimática del huésped para generar el producto proteico de interés. A medida que las bacterias se van reproduciendo, el plásmido pasa a su descendencia, así que no se pierde durante la división.
Este procedimiento usa a la bacteria como una especie de “fábrica” de proteínas. Más adelante veremos que ha sido un procedimiento muy relevante en el desarrollo de tratamientos médicos efectivos.
Una vez que el cultivo está listo y las bacterias han producido grandes cantidades de proteínas, se procede a la lisis o ruptura de la célula. Existe una amplia gama de técnicas bioquímicas que permiten la purificación de proteínas de acuerdo con sus características físico-químicas.
En otro contexto experimental puede que no nos interese generar la proteína, sino que nos interesa obtener la secuencia de ADN per se. Si fuese el caso, el plásmido serviría para la creación de múltiples copias del fragmento que nos interesa con el objetivo de tener cantidad suficiente del ADN blanco para realizar los experimentos pertinentes.
La tecnología de ADN recombinante abrió un número infinito de posibilidades a la biología molecular, biotecnología, medicina y otras áreas relacionadas. Sus aplicaciones más resaltantes son las siguientes.
La primera aplicación está directamente relacionada con los laboratorios de biología molecular. La tecnología de ADN recombinante permite a los investigadores entender la función normal de los genes, y las proteínas generadas pueden ser usadas en investigaciones posteriores.
Las proteínas producidas usando el procedimiento de ADN recombinante tienen aplicaciones en la medicina. Dos ejemplos muy relevantes en el campo son la insulina humana y la hormona de crecimiento, que se aplica en pacientes que carecen de dicha proteína.
Gracias al ADN recombinante se pueden generar estas proteínas sin necesidad de extraerlas de otro ser humano, lo cual representa complicaciones metodológicas adicionales y riesgos para la salud. Esto ha ayudado a mejorar la calidad de vida de innumerables pacientes.
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