Tinción de Wright: qué es, fundamento, componentes, técnicas, usos
¿Qué es la tinción de Wright?
La tinción de Wright es una técnica de coloración creada por el patólogo estadounidense James Homer Wright en 1902, a partir de la tinción de Romanowsky, para diferenciar mejor los distintos tipos de células de la sangre.
Esta coloración es policromática, lo que quiere decir que genera varios colores dependiendo de la estructura que absorbe el colorante. Esta técnica de coloración ha sido muy utilizada para realizar recuentos diferenciales de glóbulos blancos y estudiar la morfología de los glóbulos rojos, plaquetas y leucocitos en sangre periférica y médula ósea.
Su aplicación es muy importante, ya que se pueden apreciar anormalidades en las diferentes líneas celulares de la sangre, facilitando el diagnóstico de enfermedades como la leucemia o infecciones bacterianas o parasitarias.
Quizás estas son las aplicaciones más comunes en la que es utilizada esta técnica, sin embargo, no son las únicas. También es útil en otras muestras diferentes a la sangre y médula ósea, como por ejemplo, en muestras de secreción nasal, moco fecal, esputo, piel, entre otros.
Fundamento de la tinción de Wright
La tinción de Wright nació de la tinción de Romanowsky, que consiste en una solución de alcohol metílico de un colorante ácido (eosina Y) y otro básico (azul de metileno) y sus productos de oxidación.
La mezcla de colorantes usados en la tinción de Wright provoca el efecto conocido como Romanowsky, es decir, proporciona una hermosa coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos, mientras que los glóbulos rojos se tiñen de color rosado.
Los componentes responsables de dar la gama de colores típica de la tinción de Wright son el azul B y la eosina Y. El efecto observado dependerá del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y a las interacciones del azul B y la eosina Y.
Las estructuras ácidas, como los ácidos nucleicos, las proteínas nucleares y el citoplasma inmaduro reactivo de algunos tipos de células, fijan el azul B (colorante básico).
Mientras que las estructuras básicas, como la hemoglobina, los gránulos de los segmentados eosinófilos, entre otras estructuras celulares, fijan la eosina Y (colorante ácido).
El resultado de tinción puede ser influido por diferentes factores, como el pH del colorante Wright, de la solución amortiguadora y de lavado, así como el tiempo de tinción y de fijación.
Por ello, cada paso en la preparación de los reactivos es crucial y debe ser realizado cuidando cada detalle.
Materiales
Colorante de Wright. Para 100 mL se requiere:
Pesar 0.3 gr de colorante de Wright, medir 97 ml de metanol y 3 ml de glicerol.
Preparación
En un mortero colocar la cantidad pesada del colorante de Wright e incorporar poco a poco el glicerol hasta que el polvo quede totalmente disuelto.
Posteriormente se agrega el metanol, se mezcla y se vierte en un frasco ámbar.
Antes de usar se debe agitar la solución con movimientos suaves y filtrar.
Solución amortiguadora tamponada
En un litro de agua destilada se agrega 3,76 g de hidrofosfato disódico (Na2HPO4 2H20) más 2,1 gr de fosfato de potasio dihidrogenado (KH2PO4).
Mezclar muy bien hasta disolver todos los reactivos incorporados. Ajustar el pH a 7,2. Verter en un frasco de vidrio y mantener a temperatura ambiente.
Materiales adicionales necesarios para realizar la coloración
Adicionalmente se requieren otros materiales para poder llevar a cabo la técnica de coloración, estos son: láminas porta objetos o cubre objetos, puente de coloración, pisetas con agua o buffer para el lavado, un cronómetro para llevar los tiempos de coloración y algún material secante (papel absorbente, gasa o algodón).
Componentes de la tinción de Wright
El metanol
El alcohol (metanol) sirve como un fijador del frotis sanguíneo al portaobjetos.
Básicamente es un reactivo reductor, deshidratador y fijador coagulante. Por tanto, su función es coagular las proteínas y hacerlas insolubles, pero sin llegar a desnaturalizarlas.
El metanol es el reactivo más utilizado para fijar frotis en todos los laboratorios, ya que proporciona mejores resultados que los obtenidos con el etanol. La concentración ideal es a 99%.
El amortiguador
El amortiguador (solución tamponada), tiene como función ajustar o mantener el pH del colorante, pues un pH ajustado a 7,2 es esencial para que las estructuras celulares puedan absorber los colorantes adecuadamente.
El paso de la fijación con metanol deshidrata las células y el amortiguador ayuda a rehidratarlas.
Eosina (Y)
La eosina tiene afinidad por componentes básicos por ser un colorante ácido. Se conocen dos tipos de eosina muy similares entre sí, tanto que pueden usarse cualquiera de las dos, obteniendo el mismo resultado.
Una se denomina eosina Y, eosina amarilla o tetrabromofluoresceína, y la otra, eosina B, eritrosina B azulada o dibromodinitrofluoresceína. Sin embargo, la eosina Y es la que se utiliza con mayor frecuencia.
La propiedad más importante de este colorante es su polaridad negativa, esto hace que sea atraído por estructuras celulares con carga positiva.
Azul de metileno
Es el colorante básico. Su principal propiedad es la metacromasia, es decir, no todas las estructuras se van a teñir del mismo color, dependerá de la composición química de las estructuras que está coloreando.
Algunas se tornarán azul claro u oscuro, y otras de morado oscuro o lila pálido.
Técnica
- Realizar el extendido de la muestra de forma que quede una película delgada, bien sea en portaobjeto o cubreobjeto.
- Dejar secar al aire por 2 horas, aproximadamente.
- Colocar el frotis seco sobre el puente de coloración o cubeta de tinción con el extendido de la muestra hacia arriba.
- Cubrir la lámina con el colorante de Wright gota a gota hasta abarcar toda la superficie. Dejar actuar durante 5-8 minutos.
- El colorante deberá cubrir completamente el portaobjeto, sin que se derrame por los bordes. Si durante el tiempo de coloración se comienza a evaporar se deberán colocar unas gotas adicionales.
- Posteriormente adicionar una cantidad igual del amortiguador, soplar un poco hasta que aparezca el característico brillo metálico. Cronometrar 10 a 15 minutos.
- Lavar con agua de grifo, colocando el chorro suave hasta que la lámina se vea rosada.
- Con una gasa impregnada de alcohol eliminar el colorante adherido en el dorso del portaobjetos.
- Dejar secar muy bien el frotis antes de colocar el aceite de inmersión para visualizarlo en el microscopio.
Usos/aplicaciones de la tinción de Wright
Hematología
Es ideal para la tinción de frotis de sangre periférica, para el examen de gota gruesa de sangre y para el estudio de células de muestras de médula ósea.
Debido a las propiedades químicas de esta combinación de colorantes, las estructuras celulares pueden ser fácilmente reconocidas, pudiéndose distinguir los diferentes tipos de células presentes.
Secreción nasal
Esta técnica es muy útil para identificar las células de la secreción nasal (células epiteliales, segmentados eosinófilos, polimorfonucleares) en el diagnóstico de rinitis alérgicas.
Parasitología
En este sentido, ha sido útil para el estudio de Leishmania sp dentro de los histiocitos del tejido celular subcutáneo en úlceras de la piel. Asimismo, es empleada para identificar leucocitos en muestra de heces (leucograma fecal).
En este caso, es de interés para el médico saber si la leucocitosis presente en las heces es por polimorfonucleares o mononucleares. Este hallazgo en el leucograma fecal orientará si se trata de una infección bacteriana o viral, respectivamente.
Por otra parte, los parásitos que circulan en la sangre pueden hallarse dentro del eritrocito o libres en el plasma. Los parásitos buscados son Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii y filarias, y en veterinaria es útil en la búsqueda de Theileria equi y Babesia caballi, agentes causales de la bebesiosis, especialmente en equinos.
La coloración de Wright, y también la de Giemsa, permiten diferenciar los hemoparásitos de los componentes celulares normales. Para ello se pueden utilizar dos tipos de extendidos:
Extendidos finos
La sangre es extendida como una película delgada sobre un portaobjetos. Se tiñe con tinción de Wright, revelándose las características del núcleo y del citoplasma.
Gota gruesa
Esta metodología se usa para investigar la presencia de parásitos en una mayor cantidad de sangre.
Para ello se coloca sobre un portaobjetos una gota grande de sangre. Una vez allí se debe desfibrinar, haciendo círculos cada vez más grandes desde el centro hacia afuera, utilizando para ello el borde de otro portaobjeto.
Finalmente, para poder observar los parásitos en el frotis grueso, los eritrocitos deben ser lisados con agua.
Infecciones respiratorias
A nivel respiratorio esta técnica también es útil, debido a que las células presentes en las muestras de esputos, lavado bronquial o broncoalveolar, son importantes para establecer el diagnóstico.
Aquí pueden distinguirse las células polimorfonucleares y las células mononucleares.
Bacteriología
El uso de esta técnica en bacteriología es limitado, debido a que no es buena para teñir las bacterias. Por ello, para la tinción de las mismas, se usan otras técnicas de coloración especializadas.
Sin embargo, se ha empleado para buscar células epiteliales con cuerpos de inclusión de Chlamydia trachomatis en frotis de mucosa uretral o endocervical, aunque hay que reconocer que no es el mejor método.
También es posible observar, entre los glóbulos rojos, bacterias tipo espiral, como la Borrelia burgdorferi en pacientes infectados, así como mórulas o cuerpos de inclusión de Ehrlichia sp en el citoplasma de linfocitos, monocitos o neutrófilos en un frotis sanguíneo.
Micología
El Histoplasma capsulatum es un hongo patógeno frecuentemente diagnosticado por la observación microscópica de diversas muestras de tejidos, teñidas con tinción de Wright.
¿Cómo se observan las estructuras de la muestra sanguínea con la tinción de Wright?
Recomendaciones para una buena tinción
– Las extensiones de las muestras de sangre deben secar al aire espontáneamente. Los frotis deben ser lo más delgados posibles para obtener una mejor fijación del colorante y evitar las sobrecoloraciones.
– Para teñidos de alta calidad, se aconseja realizar la tinción durante las dos horas siguientes a la preparación del frotis. Por otra parte, la muestra ideal es sangre capilar, sin anticoagulante.
– Sin embargo, si se usa sangre venosa, se debe usar como anticoagulante EDTA y no heparina, ya que esta última puede deformar las estructuras celulares.
– Para evitar el deterioro del colorante preparado se debe guardar en lugares secos.
– Durante el proceso del lavado se recomienda el uso de agua ajustada a pH neutro.
– Es recomendable realizar pruebas a los métodos tintoriales que se usan en el laboratorio cada cierto tiempo.
Esto se realiza tiñendo muestras o extendidos patrones, a manera de control de calidad. Este paso es importante, ya que así se asegura que la tinción está adecuadamente preparada y los tiempos de coloración están bien estandarizados.
Si la lámina patrón queda mal coloreada, entonces existen problemas que deben ser resueltos.
Errores comunes en la coloración de Wright
Tinción muy pálida
Los frotis muy pálidos, por lo general se deben a un tiempo muy corto de tinción o a un lavado muy exagerado. Se corrige alargando el tiempo de contacto con el colorante o disminuyendo el tiempo de lavado.
Precipitados del colorante
La presencia de precipitados de colorante en el frotis puede tener varias causas. Las más frecuentes son: uso del colorante no filtrado, teñir sobre puentes de coloración desnivelados, usar láminas sucias con polvo o grasa, no hacer un buen lavado al culminar la tinción.
Frotis con coloración extremadamente rojiza o azul
El amortiguador es el responsable del pH del colorante. Colorantes con pH por debajo del indicado (ácido) tendrán como consecuencia la obtención de frotis muy rojizos.
Si el pH del colorante está por encima (alcalino) se obtendrá un frotis extremadamente azulado.
Modo de almacenamiento
El reactivo debe almacenarse a temperatura ambiente.
Referencias
- López-Jácome, L., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C., Ortega-Peña, S., Cerón-González, G., Franco-Cendejas, F. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en Discapacidad.
- Calderón, A., Cardona, J., Vergara, Ó. (2013). Frecuencia de Babesia spp. en caballos de montería, Córdoba (Colombia). Rev. udcaactual divulg. cient.
- Retamales, E., Mazo, V. Instituto de Salud Pública Gobierno de Chile. Recomendaciones para la tinción de frotis sanguíneos para la lectura del hemograma.