Tinción de Giemsa: qué es, fundamento, materiales, técnica, usos
¿Qué es la tinción de Giemsa?
La tinción de Giemsa es un tipo de coloración de muestras clínicas (tejidos, sangre), basada en la mezcla de colorantes ácidos y básicos. La creó Gustav Giemsa, químico y bacteriólogo alemán, que perfeccionó el trabajo de Romanowsky agregando glicerol para estabilizar los compuestos.
Los cambios generados a la técnica original de Romanowsky permitieron mejorar considerablemente las observaciones microscópicas, por ello, la técnica fue bautizada con el nombre de tinción de Giemsa.
Por ser una técnica sencilla de realizar, de gran funcionabilidad y económica, es actualmente muy utilizada en el laboratorio clínico para frotis hematológicos, muestras de médula ósea y cortes de tejido.
La técnica de tinción de Giemsa es muy útil para estudios citológicos, ya que permite la observación de estructuras específicas de las células. Esta técnica tiñe los citoplasmas, núcleos, nucléolos, vacuolas y gránulos de las células, distinguiéndose incluso finas trazas de cromatina.
Además, se pueden detectar cambios significativos en el tamaño, forma o coloración del núcleo, donde es posible visualizar la pérdida de la relación núcleo-citoplasma.
Fundamento de la tinción de Giemsa
Los colorantes tipo Romanowsky tienen como fundamento contrastar entre colorantes ácidos y básicos, para teñir las estructuras básicas y ácidas, respectivamente. Como se puede observar, existe una afinidad de los colorantes ácidos de teñir las estructuras básicas y viceversa.
El colorante básico utilizado es el azul de metileno y sus derivados oxidados (azure A y azure B), mientras que el colorante ácido es la eosina.
Las estructuras ácidas de las células son los ácidos nucleicos, los gránulos de los segmentados basófilos, entre otras. Por tanto, serán teñidos con el azul de metileno.
En este mismo sentido, las estructuras básicas de las células son la hemoglobina y algunos gránulos, como los contenidos en los segmentados eosinófilos, entre otras. Estos serán teñidos con la eosina.
Por otra parte, debido a que el azul de metileno y el azure se caracterizan por ser colorantes metacromáticos, pueden brindar una tonalidad variable a las distintas estructuras, de acuerdo a la carga de polianiones que posean.
Es así como la combinación estratégica de colorantes básicos y ácidos logran desarrollar un amplio espectro de colores, de acuerdo con las características bioquímicas de cada estructura, paseándose por tonalidades azules pálidas, azules oscuras, lila y púrpura, en el caso de las estructuras ácidas.
La coloración que brinda la eosina es más estable, generando colores entre rojizo, naranja y salmón.
Materiales
Preparación de la solución madre
La preparación de la solución madre requiere pesar 600 mg de colorante Giemsa en polvo, medir 500 cc de alcohol metílico libre de acetona y 50 cc de glicerina neutra.
Modo de preparación
Colocar el polvo de Giemsa pesado en un mortero. Si existen grumos se deben pulverizar. Posteriormente, agregar una cantidad apreciable de la glicerina medida y mezclar muy bien. La mezcla obtenida se vierte en un frasco color ámbar muy limpio.
El resto de la glicerina se coloca en el mortero. Volver a mezclar para limpiar el resto de colorante que haya quedado pegado a las paredes del mortero y echar al mismo frasco.
El frasco se tapa y se lleva durante 2 horas en baño maría a 55 ºC. Mientras se encuentre en baño de maría, realizar ligeras agitaciones de la mezcla cada media hora, aproximadamente.
Posteriormente, se deja enfriar la mezcla para colocar el alcohol. Previamente, una parte del alcohol medido se coloca en el mortero para terminar de lavar lo que quede de colorante y seguidamente se adiciona a la mezcla, junto al resto del alcohol.
Esta preparación se debe dejar madurar durante al menos 2 semanas. La porción que se vaya utilizando de la solución madre debe ser filtrada.
Para evitar la contaminación del preparado, se recomienda pasar la porción que va a estar en constante uso a un frasco ámbar pequeño con gotero. Recargar cada vez que se agote el reactivo.
Preparación de la solución buffer
Por otra parte, se prepara una solución buffer a pH 7,2 de la siguiente manera:
Se pesan 6,77 gr de fosfato de sodio (anhidro) (NaHPO4), 2,59 gr de fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4) y agua destilada hasta 1.000 cc.
Preparación final del colorante
Para la preparación de la solución final de tinción se miden 2 cc de la solución madre filtrada y se mezclan con 6 cc de la solución buffer. Se agita la mezcla.
Un dato relevante que hay que tener en cuenta es que las técnicas de preparación del colorante pueden cambiar según la casa comercial.
Materiales adicionales necesarios para realizar la coloración
Aparte de los materiales descritos, se debe disponer de puentes de coloración, pisetas con agua o buffer para el lavado, láminas portaobjetos o cubreobjetos, un cronómetro para controlar los tiempos de coloración y papel secante o algún material que sirva para secar (gasa o algodón).
Técnica
Proceso de tinción
1. Previo a la coloración se debe tener listo el extendido de la muestra sobre un portaobjetos limpio.
Las muestras pueden ser sangre, médula ósea, cortes de tejidos histológicos o muestras cérvico-vaginal. Se recomienda que los extendidos sean finos y tengan 1 o 2 horas de secado antes de colorearlos.
2. Sobre un puente de coloración se colocan todas las láminas que se tengan para colorear. Se trabaja siempre en un mismo orden y se identifica bien cada lámina.
3. Colocar unas gotas de alcohol metílico al 100% (metanol) sobre el frotis y dejar actuar por 3 a 5 minutos, con el fin de fijar y deshidratar la muestra.
4. Descartar el metanol presente en la lámina y dejar secar al aire.
5. Una vez seco, colocar con un gotero la solución final de tinción hasta cubrir la totalidad de la lámina. Dejar actuar por 15 minutos. Algunos autores recomiendan hasta 25 min. Depende de la casa comercial.
6. Escurrir el colorante y lavar el frotis con agua destilada o con solución buffer a 7,2.
7. Sobre un papel secante, dejar secar las láminas al aire libre, dispuestas en forma vertical con ayuda de un soporte.
8. Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante.
Usos/aplicaciones de la tinción de Giemsa
La técnica de tinción de Giemsa es utilizada en diversas áreas: en hematología, micología, bacteriología, parasitología, citología y citogenética.
Hematología
Es el uso más frecuente que se le da a esta tinción. Con ella se logran identificar todas y cada una de las células presentes en muestras de médula ósea o sangre periférica. Así como calcular el número de cada serie, pudiéndose detectar leucocitosis o leucopenia, trombocitopenia, etc.
Debido a que es sensible para identificar células inmaduras, es relevante en el diagnóstico de leucemias agudas o crónicas. También es posible hacer el diagnóstico de anemias, como la anemia drepanocítica, falciforme, entre otras.
Micología
En esta área es común su utilización para la búsqueda de Histoplasma capsulatum (hongo dimórfico intracelular) en muestras de tejidos.
Bacteriología
En frotis hematológicos teñidos con Giemsa, es posible detectar Borrelias sp en pacientes que cursan con la enfermedad denominada fiebre recurrentis. Las espiroquetas se observan abundantes entre los eritrocitos, en muestras tomadas en el pico febril.
También es posible visualizar bacterias intracelulares como Rickettsias sp y Chlamydia trachomatis en células infectadas.
Parasitología
En el campo de la parasitología, la tinción de Giemsa ha permitido hacer el diagnóstico de enfermedades parasitarias, como la malaria, el mal de Chagas y la leishmaniasis.
En las dos primeras, los parásitos Plasmodium sp y el Tripanosoma cruzi, respectivamente, pueden visualizarse en sangre periférica de los pacientes infectados. Los mismos pueden encontrarse en diversos estadios según la fase en la que esté la enfermedad.
Para mejorar la búsqueda de parásitos en sangre se recomienda usar la tinción de Giemsa mezclada con el colorante de May-Grünwald.
Asimismo, la leishmaniasis cutánea puede diagnosticarse al evaluar muestras de biopsias de piel teñidas con Giemsa, donde se encuentra el parásito.
Citología
La tinción de Giemsa también es usada para el estudio citológico de muestras endocervicales, aunque no sea la técnica más frecuentemente empleada para este fin.
Pero en casos de escasez de recursos puede utiilzarse, teniendo una funcionabilidad similar a la que ofrece la técnica de Papanicolaou y a un menor costo. Sin embargo, requiere de experticia por parte del examinante.
Citogenética
Una característica relevante de la tinción de Giemsa es su capacidad para unirse fuertemente a las regiones ricas en adeninas y timinas del ADN. Esto permite que el ADN pueda ser visualizado durante la mitosis de las células, en diferentes estados de condensación.
Estos estudios son necesarios para detectar aberraciones cromáticas, como duplicaciones, deleciones o translocaciones de las distintas regiones de los cromosomas.
Recomendaciones para una buena tinción
– No debe acelerarse el secado de las láminas. Se debe esperar el tiempo prudencial para el secado de la misma al aire libre. Aproximadamente 2 horas.
– Colorear inmediatamente pasadas las 2 horas para mejores resultados.
– Para que los frotis se fijen y se tiñan mejor, la muestra debe ser distribuida sobre la lámina de tal manera que quede una capa delgada y uniforme.
– La muestra de sangre preferida es la capilar, ya que el frotis se hace de manera directa de la gota de sangre y por tanto la muestra no lleva aditivo alguno, lo cual favorece el mantenimiento de las estructuras celulares.
– Si se usa sangre venosa, se debe usar EDTA como anticoagulante y no heparina, ya que esta última por lo general deforma las células.
Errores comunes en la coloración de Giemsa
En la práctica de esta coloración se pueden cometer errores. Los mismos se evidencian por cambios bruscos en las tonalidades de las estructuras.
Coloración extremadamente azul
Se puede deber a:
– Frotis muy gruesos.
– Exceder en el tiempo de tinción.
– Lavar de forma insuficiente.
– Uso de reactivos muy por encima del pH neutro (alcalino).
Bajo estas condiciones, los colores de las siguientes estructuras se distorsionan, de tal manera que los eritrocitos, en vez de teñirse de rosa-salmó,n se verán verdes, los gránulos de los eosinófilos que deben teñirse de rojo ladrillo se tornarán azulados o grises, y así sucesivamente habrá desviación en las tonalidades habituales.
Coloración excesivamente rosada
Puede deberse a:
– Tiempo de tinción insuficiente.
– Lavado prolongado o excesivo.
– Mal secado.
– Empleo de reactivos muy ácidos.
En este caso en particular, las estructuras que normalmente se tiñen de azul no serán casi visibles, mientras que las estructuras que se tiñen de rosa tendrán tonalidades muy exageradas.
Ejemplo: los eritrocitos tomarán un color rojo brillante o anaranjado fuerte, la cromatina nuclear se verá rosa pálida y los gránulos de los eosinófilos se teñirán de rojo brillante intenso.
Presencia de precipitados en el frotis
Las causas pueden ser:
– Usar láminas sucias o mal lavadas.
– No dejar secar bien el frotis.
– Dejar la solución fijadora por demasiado tiempo.
– Lavados inadecuados al concluir la tinción.
– Filtración inadecuada o no filtración del colorante que se está utilizando.
Presencia de artefactos morfológicos
En los frotis pueden aparecer artefactos morfológicos que dificultan la visualización e interpretación de las estructuras presentes. Esto se debe a:
– Tipo de anticoagulante empleado, como la heparina.
– Uso de láminas sucias, deterioradas o grasientas.
Modo de almacenamiento
Después de preparado, el colorante debe mantenerse a temperatura ambiente (15-25° C), para evitar que el colorante precipite. Debe almacenarse en envase ámbar bien cerrado.
Referencias
- Cannova, D., Brito, E. y Simons, M. (2016). Evaluación de técnicas de coloraciones para el diagnóstico de la Leishmaniasis cutánea. Salus.
- PanReac Applichem ITW Reagents. Tinción de Giemsa. Versión 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, España.
- Clark, G. Staining procedures (1981). Williams & Willkins.