Histoquímica: fundamento, procesamiento, tinciones
La histoquímica es una herramienta de gran utilidad en el estudio de la morfología de diversos tejidos biológicos (vegetales y animales), debido a su principio de reacción de los componentes tisulares como los carbohidratos, lípidos y proteínas, entre otros, con sustancias químicas colorantes.
Esta valiosa herramienta permite no solamente identificar la composición y estructura de los tejidos y células, sino también las diversas reacciones que ocurren en estos. Así mismo, se pueden evidenciar los posibles daños tisulares, ocasionados por la presencia de microorganismos u otras patologías.
La histoquímica, desde siglos pasados ha brindado importantes aportes, como la demostración de la existencia de la barrera hematoencefálica por Paul Ehrlich. Esto fue posible gracias a que el cerebro del animal de experimentación usado por Ehrlich no se tiñó con la anilina, que es un colorante básico.
Esto condujo al empleo de diversos colorantes como azules de metileno y de indofenol, con el fin de teñir los diferentes tipos de células. Este hallazgo dio origen a la clasificación de las células en acidófilas, basófilas y neutrófilas, de acuerdo a su tinción específica.
Estudios recientes han aplicado esta técnica para evidenciar la presencia de diversos compuestos, entre ellos fenoles, así como carbohidratos y lípidos no estructurales en los tejidos de la especie Litsea glaucescens, más conocida como laurel. Encontrándose estos, tanto en la hoja como en la madera.
Así mismo Colares y col, 2016, identificaron la planta de interés medicinal Tarenaya hassleriana, mediante técnicas histoquímicas. En esta especie se evidenció la presencia de almidón, mirosina, así como también compuestos fenólicos y lipofílicos.
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La histoquímica se fundamenta en la tinción de estructuras celulares o moléculas presentes en los tejidos, gracias a la afinidad de estos con colorantes específicos. La reacción de coloración de estas estructuras o moléculas en su formato original, es posteriormente visualizada en el microscopio óptico o microscopio electrónico.
La especificidad de la tinción es debida a la presencia de grupos aceptores de iones presentes en las células o moléculas de los tejidos.
Finalmente, el objetivo de las reacciones histoquímicas es poder evidenciar mediante la coloración. Desde las estructuras biológicas más grandes hasta las más pequeñas de los tejidos y las células. Esto se puede lograr gracias a que los colorantes reaccionan químicamente con las moléculas propias de los tejidos, células u organelos.
La reacción histoquímica podría conllevar pasos previos a la realización de la técnica, como por ejemplo la fijación, la inclusión y el corte del tejido. Por tanto, se debe tener en cuenta que en estos pasos se puede dañar la estructura que se desea identificar, arrojando falsos resultados negativos, aunque ella esté presente.
A pesar de ello, la fijación previa del tejido realizada adecuadamente es importante, ya que ella previene la autolisis o destrucción celular. Para ello se emplean reacciones químicas con solventes orgánicos como: formol o glutaraldehído, entre otros.
La inclusión del tejido se realiza para que este mantenga su firmeza al cortarse y así evitar que se deforme. Finalmente, el corte se realiza con un micrótomo para el estudio de muestras por microscopía óptica.
Adicionalmente, antes de proceder a realizar las tinciones histoquímicas, se recomienda incorporar controles positivos externos o internos en cada tanda de pruebas. Así como también el uso de los colorantes específicos para las estructuras a estudiar.
Desde el surgimiento de las técnicas histoquímicas hasta la actualidad, se han empleado una amplia gama de colorantes, entre los cuales cabe citar los de uso más frecuente tales como: ácido Peryódico de Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen y Gram.
Asimismo, se han empleado otros colorantes con menor frecuencia como la tinta china, la orceína o la tinción tricrómica de Masson, entre otras.
Con esta coloración se pueden observar moléculas con alto contenido de carbohidratos, tales como: el glucógeno y la mucina. Sin embargo, también es de utilidad para la identificación de microorganismos como hongos y parásitos. Además de ciertas estructuras (membrana basal) en la piel y en otros tejidos.
El fundamento de esta tinción consiste en que el colorante oxida los enlaces de carbono presentes entre dos grupos hidroxilos cercanos. Esto produce la liberación del grupo aldehído, y este es detectado por el reactivo de Schiff, arrojando un color púrpura.
El reactivo de Schiff está compuesto por fucsina básica, metabisulfito de sodio y ácido clorhídrico, siendo estos componentes los responsables de la coloración púrpura, cuando están presentes los grupos aldehídos. En caso contrario se genera un ácido incoloro.
La intensidad de la coloración va a depender de la cantidad de grupos hidroxilos presentes en los monosacáridos. Por ejemplo en los hongos, membranas basales, las mucinas y el glucógeno el color puede ir de rojo a púrpura, mientras que los núcleos se tiñen de azul.
Es una de las tinciones que presenta mayor sensibilidad en la identificación de hongos en tejidos incluidos en parafina. Esta permite la identificación de las diversas estructuras fúngicas: hifas, esporas, endosporas, entre otras. Por tanto, es considerada como una tinción de rutina para el diagnóstico de micosis.
Especialmente es usada en el diagnóstico de micosis pulmonares como la neumocistosis y aspergilosis causadas por algunos hongos de los géneros Pneumocystis y Aspergillus, respectivamente.
Esta solución contiene nitrato de plata y ácido crómico, siendo este último un fijador y colorante. El fundamento consiste en que este ácido produce la oxidación de los grupos hidroxilos a aldehídos, por los mucopoliacáridos presentes en las estructuras micóticas, por ejemplo en la pared celular de los hongos.
Finalmente, la plata presente en la solución es oxidada por los aldehídos, originando una coloración negra, a la que se le denomina reacción argentafin. También se pueden emplear colorantes de contraste como el verde claro y así se observaran las estructuras fúngicas en negro con un fondo verde claro.
Esta tinción se fundamenta en la presencia de ácido-alcohol resistencia, de manera parcial o total, en algunos microorganismos como por ejemplo los géneros Nocardia, Legionella y Mycobacterium.
El uso de esta tinción es recomendado, debido a que la pared celular de los microorganismos previamente citados, contiene lípidos complejos que obstaculizan la penetración de los colorantes. Especialmente en muestras del tracto respiratorio.
En ella se emplean colorantes fuertes como la fucsina fenicada (colorante básico) y se aplica calor para que el microorganismo pueda retener el colorante y no se decolore con los ácidos y alcoholes. Finalmente se aplica una solución de azul de metileno para colorear las estructuras que se hayan decolorado.
La presencia de ácido-alcohol resistencia se observa en las estructuras teñidas de rojo, mientras que las estructuras que no resisten la decoloración son teñidas de azul.
El Gram es una coloración muy útil en el diagnóstico de infecciones bacterianas y micóticas, entre otras. Esta coloración permite diferenciar entre los microorganismos Gram positivos de los Gram negativos, evidenciando claramente las diferencias que existen en la composición de la pared celular.
Mientras que la tinta china es una tinción que se usa para contrastar las estructuras que contienen polisacáridos (cápsula). Esto se debe a que se forma un anillo en el entorno, siendo posible en el Cryptococcus neoformans.
Con esta tinción se colorean las fibras elásticas y cromosomas de diversas células, permitiendo la evaluación del proceso de maduración de estas últimas. Por tal motivo, ha sido de gran utilidad en los estudios citogenéticos.
Esta se fundamenta en la captación del colorante por la carga negativa de moléculas como el ADN, presente en los núcleos de la gran variedad de células. Por lo que estos se tiñen de color azul a violeta oscuro.
Esta tinción es empleada en la identificación de algunos microorganismos o materiales que contienen pigmentos melánicos. Es el caso de las micosis, causadas por hongos dematiáceos, feohifomicosis y en eumicetoma de grano negro.
En los últimos años ha habido muchos avances en la creación de nuevas técnicas diagnósticas, en donde se involucra la histoquímica pero ligada a otros fundamentos o principios. Estas técnicas persiguen una finalidad diferente, como es el caso de la inmunohistoquímica o la enzimohistoquímica.
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