Medio Löwenstein-Jensen: fundamento, preparación y uso
El medio Löwenstein-Jensen es un medio sólido selectivo para el aislamiento y desarrollo de bacterias del género Mycobacterium, tales como Mycobacterium tuberculosis, M. avium, entre otras, a excepción de la especie leprae, que no es cultivable.
Las bacterias del género Mycobacterium no crecen en medios de cultivo convencionales, por tanto fue necesario diseñar un medio especial para su aislamiento. El medio original fue creado por Löwenstein y luego fue modificado por Jensen.
La modificación consistió en la eliminación del colorante rojo congo, sustituyéndolo por mayor concentración de verde de malaquita. Además alteró las concentraciones de citrato de magnesio y fosfato monopotásico.
El medio Löwenstein-Jensen actualmente contiene almidón de papata, asparragina, citrato magnésico, fosfato monopotásico, sulfato magnésico, verde de malaquita, ácido nalidíxico, cicloheximida, lincomicina, huevos batidos, glicerina y agua.
Las micobacterias se aíslan normalmente de sitios que no son estériles, como esputos, orina, abscesos, entre otros. Esto quiere decir que la mayoría de las muestras contendrán microbiota habitual del área, más el patógeno.
Es por ello que el medio Löwenstein-Jensen contiene una serie de inhibidores en su composición representados por el verde de malaquita, antibióticos y antifúngicos.
Además, las muestras que provienen de sitio no estériles deben ser descontaminadas y neutralizadas antes de ser sembradas en el medio Löwenstein-Jensen.
Índice del artículo
La presencia de huevo y glicerina en el medio Löwenstein-Jensen estimula el crecimiento de las micobacterias debido a que proporcionan los ácidos grasos y las proteínas necesarias para el desarrollo de estos microorganismos.
El medio Löwenstein-Jensen contiene verde de malaquita, que es un inhibidor de la microbiota acompañante. Pero además contiene ácido nalidíxico (35 µg/mL), que inhibe la microbiota Gram negativa, cicloheximida (400 µg/mL), que inhibe los hongos y levaduras saprófitos, y lincomicina (2µ/mL), que inhibe la microbiota Gram positiva.
Algunas casas comerciales prefieren añadir la siguiente combinación de antibióticos: polimixina B 200.000 unidades/L, anfotericina B 10 mg/L, carbenicilina 50 mg/L y trimetoprima 10 mg/L.
Este medio no contiene agar, por tanto la solidificación del medio ocurre por la coagulación de la albúmina presente en el huevo durante la esterilización.
Pese 37,3 g del medio deshidratado en 600 ml de agua destilada a la que previamente se le ha adicionado 12 ml de glicerol. Se calienta la mezcla, agitando frecuentemente hasta su disolución total. Autoclavar el medio a 121 ° C por 15 minutos.
Por otra parte, se debe preparar una suspensión homogénea de 1000 ml de huevos frescos en condiciones asépticas. Adicionar la suspensión de huevo a los 600 ml de medio preparado a una temperatura de 50 – 60 °C, evitando las burbujas de aire.
Las soluciones de antibióticos también se le agregan después de la esterilización en el autoclave.
Vierta el medio en tubos de ensayo estériles con tapón de rosca. Calentar los tubos a 85°C por 45 minutos en posición inclinada.
El color del medio preparado es verde aguamarina y puede presentar puntos blanquecinos por la presencia de lípidos del huevo.
El pH del medio debe quedar en 7,2 ± 0,2
Guardar los tubos en nevera y protegidos de la luz directa hasta su uso. Atemperar antes de sembrar.
Existe una modificación del medio denominado “modificación de Gruft del Löwenstein Jensen”. Este contiene los mismos compuestos que el medio clásico pero se le agrega RNA-5mg/100 mL, y como inhibidores contiene verde de malaquita 0,025 g/100 mL, penicilina 50 U/mL y ácido nalidíxico 35 ug/mL.
El medio Löwenstein-Jensen se usa para el aislamiento de micobacterias, a partir de diversos tipos de muestras. Se recomienda realizar una tinción de Ziehl-Neelsen a toda muestra en la que se sospeche la presencia de micobacterias.
Algunas muestras provienen de sitios estériles pero otras no. Las muestras no estériles deben ser descontaminadas según sea el caso:
Las muestras de esputos se deben descontaminar de la siguiente manera: determine la cantidad de muestra de esputo en ml y agregue a la muestra la misma cantidad de NaOH al 4% e incube a 37°C.
Agite la mezcla frecuentemente en un período de 30 minutos. Posteriormente centrifugue a 3000 RPM por 30 minutos.
Descartar el sobrenadante sobre una solución de desinfectante fenólico. Usar el sedimento para sembrar, pero antes se debe neutralizar el pH.
Para neutralizar el sedimento se utiliza H2SO4 al 5% en presencia del indicador rojo de fenol hasta llevar a un pH neutro que origina un color salmón.
En este caso se debe centrifugar la muestra a 3000 RPM por 30 minutos. Se descarta el sobrenadante y se usa el sedimento. Para descontaminar el sedimento se adiciona 3 ml de NaOH al 4% y se agita frecuentemente a 37°C por un lapso de media hora.
Centrifugar nuevamente, se descarta el sobrenadante y se usa el sedimento. Este último se debe neutralizar como fue explicado en la muestra de esputo.
Dejar sedimentar la muestra en la nevera durante 24 horas. Separar el sobrenadante. El sedimento restante debe centrifugarse por 30 minutos a 3000 RMP. Descartar nuevamente el sobrenadante y reconstituir el sedimento con 3 ml de solución fisiológica estéril.
Adicionar 3 ml de NaOH al 4% y proceder a la descontaminación y neutralización tal como se ha descrito antes.
En este tipo de muestra se centrifuga y se descarta el sobrenadante. Realizar un Gram al sedimento u observar directamente en el microscopio; si no se observan bacterias no es necesario el paso de la descontaminación y tampoco el de neutralización.
En este caso la muestra se puede sembrar de forma directa usando el sedimento. En caso de existir bacterias proceder a descontaminar y neutralizar como se ha descrito anteriormente.
A este tipo de muestra se le debe adicionar 5 ml de agua destilada para posteriormente centrifugar a 1500 RPM por 10 minutos. Descartar el sobrenadante y volver a centrifugar el sedimento a 3500 RPM por 30 minutos. Utilizar el sedimento para sembrar el medio de cultivo.
El hisopo debe introducirse en un tubo estéril que contenga partes iguales de agua destilada y NaOH al 4%. El hisopo se debe presionar sobre las paredes del tubo para que la muestra sea diluida en el líquido. Centrifugar y usar el sedimento. Neutralizar el sedimento como ya ha sido descrito.
El medio Löwenstein-Jensen se inoculan agregando 0,5 ml de la muestra sobre la superficie del medio. Rotar el tubo para distribuir la muestra en todo el medio. No usar asa de platino.
Se puede sembrar un segundo tubo que contenga medio Stonebrink con la finalidad de aislar Mycobacterium bovis y otras especies que no crecen en el medio Löwenstein-Jensen.
Los tubos inoculados se incuban en aerobiosis a 37°C, con la tapa un poco floja e inclinados a 5° aproximadamente y protegidos de la luz. Se puede enriquecer el ambiente con dióxido de carbono al 5–10%. Revisar los cultivos dos veces por semana hasta la aparición de colonias.
Cuando la muestra haya sido absorbida se ajustan las tapas. El tiempo máximo de incubación es de 8 semanas, si al cabo de este tiempo no hay crecimiento se reporta como negativo.
Como control de calidad se pueden usar las siguientes cepas:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045
Para las tres primeras especies mencionadas se espera un excelente desarrollo, para M. fortuitum el crecimiento debe ser bueno, mientras que para M. bovis se espera un crecimiento escaso o nulo. En tanto que, las especies diferentes al género Mycobacterium deben ser inhibidas en su totalidad.
El medio preparado debe protegerse de la luz, la exposición prolongada a la luz hace que el medio vire de verde a azul, en este caso ya no se puede utilizar el medio. Esto se debe a que el verde de malaquita es fotosensible.
El medio, como contiene huevo, puede ser fácilmente contaminado si no se manipula asépticamente. Puede ser disuelto si se contamina con bacterias proteolíticas.
El cultivo y manipulación de bacterias del género Mycobacterium requiere de un personal calificado, que sea consciente de las medidas de bioseguridad que debe cumplir para evitar ser contaminado o contaminar a otros.
No se debe usar HCl en el paso de la neutralización debido a la formación de cloruro de sodio, que puede ser tóxico para el bacilo de Koch.
Las muestras deben mantenerse refrigeradas y protegidas de la luz mientras no sean procesadas.
- Laboratorios Francisco Soria Melguizo. 2009. Löwenstein-Jensen selective medium. Disponible en: f-soria.es
- Laboratorios Britania. 2017. Löwenstein-Jensen medium. Disponible en: britanialab.com.
- Laboratorios Neogen. Löwenstein-Jensen médium. Disponible en: foodsafety.neogen.com.
- “Medio de Löwenstein-Jensen.” Wikipedia, La enciclopedia libre. 20 nov 2018, 15:15 UTC. 24 abr 2019, 18:34. wikipedia.org
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