Agar papa dextrosa: fundamento, preparación y uso
El agar papa dextrosa es un medio de cultivo nutritivo sólido, no selectivo. En él pueden crecer especies bacterianas y fúngicas, pero su uso está indicado especialmente para el aislamiento de hongos filamentosos y levaduras. También es conocido como medio PDA por la expresión en ingles Potato Dextrose Agar.
Es particularmente útil para el aislamiento de hongos fitopatógenos, es decir, aquellos que afectan a los vegetales. Para sembrar las muestras provenientes de vegetales infectados se pueden usar otros medios como el agar Sabouraud o malta- agar, sin embargo para el uso rutinario se prefiere el agar papa dextrosa por obtenerse mayor esporulación.
También es utilizado para el recuento de colonias fúngicas en muestras de cosméticos, productos farmacéuticos y algunos alimentos lácteos. Así mismo, es propicio para sembrar muestras de raspados de piel en busca de dermatofitos, los cuales crecen muy bien en este medio, desarrollando sus pigmentos característicos.
El medio papa dextrosa es un medio muy sencillo y fácil de preparar en el laboratorio. Contiene, como su nombre lo indica, infusión de papa, dextrosa y agar-agar. Adicionalmente pueden agregársele sustancias inhibidoras para evitar el crecimiento bacteriano y aumentar la selectividad para especies de hongos.
Índice del artículo
El agar papa dextrosa es un medio de cultivo que aporta los elementos nutricionales necesarios para el desarrollo de hongos filamentosos y levaduras.
La combinación de la infusión de papa con la glucosa proporciona la fuente de energía perfecta para que exista un crecimiento satisfactorio de los hongos. Mientras que el agar es quien brinda la consistencia al medio.
El medio por sí solo no inhibe el crecimiento de las bacterias, por tanto es un medio no selectivo. Para hacerlo selectivo necesita el agregado de sustancias inhibidoras como el ácido tartárico o los antibióticos.
Placas de Petri
Se prepara de la siguiente manera:
En primer lugar, se lavan muy bien las papas quitando la tierra que posean. Se cortan en rodajas finas con todo y concha. Se pesan 200 gr de papas y se colocan a hervir en un litro de agua destilada, durante media hora.
Terminado el tiempo se filtra o cuela todo el preparado a través de una gasa.
El líquido obtenido se completa con agua destilada hasta llegar a un litro. A la infusión se le adicionan 20 gr de agar-agar y 20 gr de dextrosa, se mezcla bien y se autoclava a 121°C, a 15 libras de presión por 15 minutos.
Dejar enfriar hasta 50°C y servir en placas de Petri estériles. Las placas preparadas se conservan en nevera.
Cuñas
También se pueden preparar cuñas de agar papa dextrosa.
En este caso antes de esterilizar en el autoclave se colocan de 12 a 15 ml del medio en tubos, posteriormente se autoclavan y al salir se acuestan en soportes especiales hasta que solidifique. Guardar en nevera.
El medio queda a un pH de 5.6 ± 0.2, sin embargo, algunos laboratorios añaden ácido tartárico al 10% para bajar el pH a 3,1 ± 0.1 con la finalidad de inhibir el crecimiento bacteriano.
En este mismo sentido, otros laboratorios prefieren añadir antibióticos para hacerlo selectivo para el cultivo de hongos y evitar el desarrollo bacteriano.
Pesar 39 gr del medio deshidratado disponible comercialmente y disolver en un litro de agua destilada. Dejar en reposo por 5 minutos.
La mezcla se calienta agitando frecuentemente hasta su disolución total. Posteriormente se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
Se pueden preparar placas o cuñas. Proceder como fue descrito anteriormente.
El pH queda en 5,6 ± 0,2. Si se desea el pH de 3,1 se deben agregar 14 ml de ácido tartárico estéril al 20% antes de servir en las placas.
El color del medio sin preparar es beige y preparado es ámbar claro con un aspecto ligeramente turbio u opalescente.
-Para las hojas con manchas
Las hojas se cortan en pedazos.
En un vaso de 50 cc con alcohol al 50% colocar los trozos de las hojas (pedazos manchados y sanos), para desinfectar la superficie por 20 a 30 segundos. Tirar el alcohol y agregar hipoclorito de sodio al 20% por 40 a 50 segundos si son hojas finas y aumentar el tiempo a 80 segundos si se trata de cortezas y troncos.
Tirar el hipoclorito de sodio y tomar con una pinza estéril los pedacitos desinfectados y colocarlos en la superficie del medio (un máximo de 10 pedazos). Colocar la fecha e incubar de 20 a 30 °C.
-Para frutos y tubérculos
Si la fruta es carnosa, abrir la fruta afectada por el hongo y tomar trozos con un bisturí estéril, tanto de la parte enferma como de la sana y colocarlo sobre la superficie del agar.
Si la fruta es cítrica, como por ejemplo un limón o una naranja, se debe abrir y sembrar sus semillas.
Cuando la superficie de la fruta está afectada y se observan esporos, lo ideal es utilizar el método de rallado sobre la placa; este consiste en tocar los esporos con una espátula en forma de “L” esterilizada y enfriada, y posteriormente realizar un sembrado en zigzag 2 a 3 veces sobre el agar.
-Para granos
Se desinfectan igual que se describió en las hojas y posteriormente se colocan en el agar.
-Para ramas y tallos
Se realiza un raspado de la corteza y posteriormente se toman trozos de la parte sana y enferma y se siembran directamente sobre el agar.
Las placas sembradas se incuban en aerobiosis a 20-30°C durante 72 horas.
La toma de muestra se debe realizar utilizando una hoja de bisturí Nº 11, bien sea para cortar cabello afectado, escamas de la piel o uñas en busca de dermatofitos. Antes de tomar la muestra se debe desinfectar el área con alcohol al 70%.
-Muestra de piel
En las lesiones escamativas se debe raspar el borde de la lesión, pues allí es más probable encontrar al hongo.
En lesiones exudativas la muestra se toma con torunda seca o húmeda. Sembrar inmediatamente sobre el agar papa dextrosa o agar Sabouraud. Evitar medios de transporte.
Otro método de toma de muestra es a través de la técnica del cuadrado de moqueta de Mariat y Adan Campos. En este caso se frota la zona afectada 5 veces con un trozo de lana estéril para su posterior cultivo.
La muestra se puede colocar directamente en el medio de cultivo.
-Muestra de pelo
Dependiendo de la patología pueden ser cortada la parte afectada o arrancados de raíz. Colocar la muestra en el medio de cultivo.
-Muestra de uña
Se pueden hacer raspados o cortar una parte específica de la uña afectada. Va a depender del tipo de lesión.
Cortar la muestra en pedacitos de 1 mm antes de sembrar con el fin de aumentar la probabilidad de contacto del hongo con el medio de cultivo.
Las colonias obtenidas en la placa se aíslan en tubos que contengan agar papa dextrosa para de allí realizar el estudio macroscópico de las colonias (aspecto, color, consistencia, grado de desarrollo.
El estudio microscópico (observación de estructuras y sus formaciones), se puede hacer por microcultivos u observación directa al microscopio entre lámina y laminilla.
Este medio también se puede utilizar para determinar la carga de hongos y levaduras presentes en muestras vegetales, alimentos, cosméticos o fármacos. Para este fin se usa agar papa dextrosa suplementado con antibióticos, tales como: (cloranfenicol, clorotetraciclina o ambos).
Verter 1 ml de la muestra -preferiblemente diluida- en una placa de Petri estéril y vacía, posteriormente fundir un taco de agar papa dextrosa y dejar enfriar a 45 °C. Verter sobre la placa de Petri y rotar hasta homogenizar. Dejar en reposo hasta que solidifique.
Incubar en aerobiosis a 20-25°C (mohos) o a 30-32°C (levaduras) por 5 a 7 días o más, dependiendo del tipo de hongo que se busca y el tipo de muestra. Pueden usarse dos placas para incubar en ambos rangos de temperaturas.
El agar papa dextrosa puede utilizarse para mantener cepas de hongos viables por varios años.
Para ello se cultiva el hongo en cuñas de agar papa dextrosa y una vez crecido el hongo, este se cubre con aceite mineral. El aceite debe ser esterilizado en autoclave por 45 minutos, y tener una viscosidad aproximada de 300 a 330 Saybolt. El aceite debe sobrepasar de 1 a 2 cm la punta del bisel.
De cada lote preparado se debe tomar 1 o 2 placas e incubarlas a 25 °C por 48 horas o a 20°C por 96 horas. Un buen control de esterilidad es aquel en el que no se observa desarrollo de colonias.
También se pueden usar cepas controles conocidas o certificadas tales como:
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533. En todos los casos se espera un buen crecimiento.
- Laboratorios Britania. Papa glucosado agar. 2015. Disponible en: britanialab.com
- Laboratorios Neogen. Potato Dextrose agar. Disponible en: foodsafety.neogen.com
- Laboratorio Insumolab. Agar papa dextrosa. Disponible en: insumolab.cl
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