Biuret: fundamento, reactivos, procedimiento, usos
El Biuret es un reactivo que se emplea para la determinación de proteínas de cadena larga y de cadena corta. Es especialmente utilizado en el área de química analítica y uroanálisis para investigar la concentración de proteínas totales en suero, plasma y orina.
Los valores de proteínas pueden aumentarse o disminuirse en ciertas patologías. Suelen presentarse cuadros de hipoproteinemias en pacientes con enfermedad renal, en desnutridos y en pacientes con infecciones crónicas.
Mientras que se observa hiperproteinemia en patologías como el mieloma múltiple, lupus eritematoso sistémico, endocarditis bacteriana, meningitis bacteriana, macroglobulinemia de Waldenstrom, entre otras.
Por otra parte, la presencia de proteínas en la orina se debe a la filtración de albúmina por el riñón. Esto es un comportamiento patológico que debe estudiarse.
En este sentido, el Biuret es de gran utilidad, pues permite cuantificar la presencia de proteínas en suero, plasma, orina, entre muchas otras muestras.
Inclusive el Biuret se puede emplear para investigar la presencia y la concentración de proteínas en muestras poco exploradas o de composición desconocidas. Por tanto, es muy utilizado en el área de investigación.
La prueba de Biuret se fundamenta en detectar los enlaces peptídicos. La prueba se da en medio alcalino. La muestra debe contener al menos dos enlaces peptídicos para que se pueda formar un complejo de color violeta-púrpura. El complejo se forma por la unión de los enlaces y el ión de cobre.
Índice del artículo
El reactivo de Biuret está compuesto por hidróxido de potasio, sulfato cúprico y tartrato de sodio y de potasio. El hidróxido de sodio se utiliza para alcalinizar el medio, ya que esta condición es indispensable para que se dé la reacción.
Las sustancias que reaccionan con las proteínas es el sulfato cúprico, mientras que el tartrato de sodio tiene como función no permitir la formación de hidróxido de cobre, el cual tiende a precipitar e interfiere en la reacción.
Si en la muestra se encuentran sustancias que posean enlaces peptídicos (polipéptidos o proteínas) la prueba dará positiva.
Una reacción se interpreta como positiva cuando la solución se torna de color violeta. El color se produce por la formación de un complejo entre al menos dos enlaces peptídicos que poseen el grupo CO-NH y los cationes cúpricos.
El complejo violeta se puede formar de dos maneras: una es por la pérdida de protones de los grupos amidas que se unen al metal (despronotación), y la otra por la unión de los electrones de oxígeno y nitrógeno que se encuentren libres y se unen con el cobre.
Esta reacción puede variar en intensidad y en el color dependiendo del tipo de proteína.
La prueba se puede realizar de forma cualitativa o cuantitativa. En la forma cualitativa se reporta como positivo o negativo. Mientras que en la forma cuantitativa se puede medir la concentración por el método espectrofotométrico.
La reacción se lee entre 540-560 nm. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de enlaces peptídicos de la muestra.
-Hidróxido de sodio (NaOH) al 20%
-Sulfato cúprico pentahidratado al 1% (CuSO4. 5H2O)
-Tartrato mixto de sodio y potasio tetrahidratado (KNaC4H4O6·4H2O)
-Debe conservarse en refrigeración.
-Colocar 100 µl de la muestra o del patrón a analizar en un tubo de ensayo.
-Adicionar 2 ml de hidróxido de sodio.
-Mezclar muy bien.
-Adicionar 5 ml de reactivo de Biuret.
-Mezclar y dejar en reposo 25 minutos a temperatura ambiente, tapar y proteger de la luz.
-Observar la formación o no de color y medir espectofotométricamente.
Para realizar la curva de calibración se puede utilizar albúmina sérica bovina como patrón. De ella se preparan varias concentraciones. Por ejemplo 25, 50, 75, 100, 125 y 150%.
Se monta la reacción con todas estas concentraciones conocidas y se lee la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm. Con los datos de las concentraciones conocidas y las lecturas de absorbancias se realiza la curva de calibración.
En cada determinación o lote de muestras procesadas es recomendable montar un patrón. Como patrón de calibración se puede utilizar albúmina sérica bovina al 0,1-2 mg/ml.
Las mediciones se realizan en un espectofotómetro a 540 nm.
Se cumple la linealidad hasta una concentración de 12 g/dl.
Aunque no es muy frecuente, hay que destacar que durante la ejecución de esta prueba pueden interferir algunas sustancias. Por ejemplo, la presencia de amonio puede inhibir la formación del color.
Así mismo, otras sustancias podrían absorber a la misma longitud de onda, como por ejemplo ciertos pigmentos.
Por otra parte, se puede generar una interferencia cuando otra sustancia diferente al enlace peptídico forma un complejo con la sal cúprica. Ejemplo: algunos carbohidratos y ciertos lípidos.
En caso de que la muestra a analizar presente algún tipo de precipitado, esta debe filtrarse o centrifugarse antes de montar la prueba.
La prueba no se ve afectada por la presencia de:
-Bilirrubina hasta una concentración de 20 mg/dl.
-Hemoglobina hasta una concentración de 750 mg/dl.
-Dextrano hasta una concentración de 30 g/L.
-Triglicéridos hasta una concentración de 4000 mg/dl.
-Es un método sencillo de ejecutar.
-Es una prueba económica.
-Tiene alta especificidad para proteínas.
-Pocas interferencias.
Tiene poca sensibilidad para detectar bajas cantidades de proteínas. El trabajo realizado por Fuentes y colaboradores afirma que el método de la prueba de Biuret posee un límite de detección de 1 mg/ml de proteína y un límite de cuantificación de 3 mg/ml.
Sin embargo, otra investigación realizada en la Universidad de Amazonía reportan valores mucho más bajos. El límite de detección que el estudio reporta es de 0,020 mg/ml y el límite de cuantificación de 1.33 mg/ml.
El reactivo o prueba de Biuret se utiliza para la determinación de proteínas en muestras clínicas y no clínicas en los laboratorios de rutina y de investigación.
En muchas patologías es importante determinar la concentración de proteínas totales en muestras clínicas, pudiendo estar elevadas o disminuidas.
Se encuentran elevadas en:
-Mieloma múltiple,
-Lupus eritematoso sistémico,
-Endocarditis bacteriana,
-Meningitis bacteriana,
Macroglobulinemia de Waldenstrom, entre otras.
Se encuentra disminuidas en:
-Insuficiencia renal,
-Personas con grados de desnutrición severos,
-Pacientes con infecciones crónicas, entre otras.
Las muestras clínicas más comunes son suero, plasma y orina. El valor normal de las proteínas en suero o plasma es de 6.0-8.8 gr/dl.
La concentración de proteínas en la orina en adultos no sobrepasar la cifra de 150 mg/24 horas.
Valor normal de índice proteína en orina/creatinina en orina
Lactantes: a 0,50 mg
Niños de 2 años en adelante: índice: 0,20 mg
Adultos: 0,2 mg
La reacción de Biuret puede usarse para muchos tipos de muestras no clínicas, como por ejemplo en productos lácteos, sueros antiofídicos o cualquier sustancia desconocida a la cual se le quiera investigar la presencia de proteínas.
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